家蠶卵蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺的優(yōu)化及有性與孤雌生殖的比較蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是后基因組學(xué)的主要內(nèi)容之一，其近年來發(fā)展十分迅速，主要涉及兩方面的內(nèi)容：一是分離和分析細(xì)胞與組織樣品的全蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究；二是通過對不同狀態(tài)樣品蛋白質(zhì)豐度差異的考察來揭示功能，即蛋白質(zhì)組功能模式的研究，從而實現(xiàn)闡明生物生理/病理的機(jī)理以及尋找靶分子等目的。蛋白質(zhì)組學(xué)雖然問世時間很短，但在生物分子的分析方面得到了極其廣泛的應(yīng)用。目前，國際上眾多大型研究機(jī)構(gòu)和藥物公司投入大量的人力和物力進(jìn)行

2、蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用性研究，已在疾病、癌癥和老年性癡呆等臨床診斷和治療方面取得了重要進(jìn)展，鑒定了一批疾病和腫瘤相關(guān)蛋白，為病理的早期診斷、藥靶的發(fā)現(xiàn)以及療效判斷等提供了重要線索，并有著十分誘人的前景。 本博士學(xué)位論文工作是建立和發(fā)展了家蠶卵蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺，優(yōu)化了家蠶卵蛋白質(zhì)組二維凝膠電泳(2-DE)圖譜，并從而對家蠶的有性和孤雌生殖進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組分析和生物信息學(xué)的研究。本論文主要內(nèi)容如下： 第一章主要綜述了家蠶蛋白質(zhì)組

3、學(xué)的進(jìn)展，包括蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)-2-DE、生物質(zhì)譜(MS)以及生物信息學(xué)的進(jìn)展和現(xiàn)狀；概述了家蠶蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展和有待進(jìn)行前沿領(lǐng)域研究的內(nèi)容，提出了本課題工作的研究方向。綜述還簡要介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)其它互補(bǔ)分離技術(shù)如兩維、多維色譜分離技術(shù)、抗體芯片和串聯(lián)親和純化技術(shù)等。 第二章涉及的研究工作是家蠶樣品的獲取。為獲得家蠶有性生殖與孤雌生殖卵及蟻蠶樣品，本工作采用浸酸處理獲得有性生殖樣品及Astaurov的溫湯處理作為孤雌誘

4、導(dǎo)條件，并在前人研究基礎(chǔ)和本實驗室現(xiàn)有條件下對家蠶孤雌生殖孵化的一些處理條件做了實驗條件摸索。實驗結(jié)果表明高溫激變方法可獲取較滿意的無性繁殖發(fā)育卵和孵殖率；并且高溫刺激方法獲得的孵化率在一定時間范圍內(nèi)隨著卵齡的增加孵化率有所提高。本實驗因此獲得了足量樣品量以用于蛋白質(zhì)組實驗研究目的。 第三章研究內(nèi)容為2-DE樣品上樣方式的改進(jìn)。該上樣方式改進(jìn)了傳統(tǒng)的上樣技術(shù)，采用八孔道加樣器和獨特的上樣程序減小了蛋白樣品的損失。2-DE是目前蛋

5、白質(zhì)組研究中用來分離復(fù)雜蛋白體系的最重要的手段，2-DE的技術(shù)流程包括電泳前的樣品制備-上樣-固相第一向電泳-第二向電泳-染色及圖譜分析等，其中上樣步驟對2-DE的結(jié)果至關(guān)重要。現(xiàn)有的2-DE的上樣方式主要有水化上樣(混合上樣)和杯上樣兩種。水化上樣方式極大的受到了上樣過程中蛋白質(zhì)吸附現(xiàn)象的影響，導(dǎo)致樣品蛋白質(zhì)損失達(dá)25-55％；杯上樣的2-DE圖譜結(jié)果通常優(yōu)于水化上樣，但耗時較長；而且水化后需人工將膠條轉(zhuǎn)移至等電聚焦裝置，容易帶進(jìn)人為

6、的誤差。本實驗改進(jìn)的上樣方式通過采用八孔道加樣器，先將水化液轉(zhuǎn)移到膠條槽內(nèi)，再將樣品以均勻滴加的方式分布在水化液滴上，在重漲膠條過程中施加電壓。改進(jìn)的上樣方式減小了水化上樣2-DE過程中蛋白質(zhì)的丟失，有利于膠條對蛋白質(zhì)的吸收。實驗結(jié)果表明，該方法電泳結(jié)果較常規(guī)的水化上樣有明顯的改善(952±15vs586±12)；同時，八孔道加樣器使用簡單和可確保實驗的重復(fù)性。通過考察這兩種上樣方法對蛋白質(zhì)回收率的大小的影響，發(fā)現(xiàn)該上樣方式蛋白質(zhì)回收率

7、比水化上樣高出約20％，從而進(jìn)一步確認(rèn)了2-DE電泳的結(jié)果。 第四章工作是一種新的家蠶卵蛋白樣品制備方法的研究。新的樣品制備方法采用兩步法抽提易溶性和難溶性樣品后，再將易溶性樣品以優(yōu)化比例加入到難溶性樣品，從而大大降低了易溶性高豐度蛋白的干擾。樣品的制備無疑是蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE電泳分離最為重要和關(guān)鍵的一步。在對家蠶卵進(jìn)行2-DE分離時，我們注意到由于卵的一些高豐度蛋白質(zhì)如卵黃磷蛋白質(zhì)(Vtn)、卵特異蛋白(ESP)和30KP家族

8、蛋白質(zhì)在樣品中占據(jù)了相當(dāng)?shù)谋壤?，?dǎo)致了許多低豐度蛋白質(zhì)很難被檢測。本研究工作成功建立的一種蠶卵蛋白質(zhì)制備的新方法，通過采取獨特的預(yù)分離策略有效減少了蠶卵樣品中高豐度蛋白質(zhì)含量，從而提高了低豐度蛋白質(zhì)的上樣量。與傳統(tǒng)的“一步提取法”的比較顯示出，該方法大大提高圖譜蛋白點的檢出率；選取了部分獨有的蛋白質(zhì)點進(jìn)行了成功的基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOFMS)鑒定和功能分類及分析，證實了該方法應(yīng)用于研究對象的有效性和適用

9、性。 采用該制備方法獲得了據(jù)我們所知迄今為止分離蠶卵樣品最多點的蛋白質(zhì)組圖譜，這將有利于更多生物相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定，為構(gòu)建較完善的蠶卵蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。 第五章研究了家蠶有性生殖和孤雌生殖的比較蛋白質(zhì)組。所述研究工作采取蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段分析了家蠶有性和孤雌生殖蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化。通過2-DE分離和電泳圖像分析、對差異點進(jìn)行膠內(nèi)酶解以及MALDIMS和MS/MS的鑒定，共有46個差異