棉花轉錄因子GhWRKY23基因的分離及功能分析.pdf

1、棉花在其生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受各種逆境脅迫，包括生物脅迫（黃萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌和植食性昆蟲咬食等）和非生物脅迫（干旱、高鹽等），對棉花的品質和產(chǎn)量造成一定的不利影響。培育抗病抗逆新品種是解決棉花病害問題的有效途徑，而這依賴于其抗病抗逆分子機制的研究。信號轉導和轉錄水平的基因表達調控在植物抵御外界脅迫中起著重要作用。轉錄因子，如DREB、NAC、WRKY、MYB等，在響應逆境脅迫反應中起重要的調節(jié)作用。分離、鑒定參與逆境脅迫應答的

2、轉錄因子并開展其功能研究是揭示植物抗病及抗逆分子機制的重要途徑。鑒于此，本研究以陸地棉為材料，利用同源克隆與RACE PCR的方法分離得到一個II類WRKY基因，同時對該基因進行了序列特征分析、表達特性分析及生物學功能鑒定，主要結果如下：
　?。?）序列分析表明，GhWRKY23 cDNA全長1194bp，包括121bp的5'UTR，125bp的3'UTR和948bp的開放閱讀框。該ORF編碼一個含有315個氨基酸的多肽，預測其分

3、子量約為35.6kDa，等電點為5.94。基因組序列分析、同源序列比對和蛋白聚類分析表明，GhWRKY23屬于IIc類WRKY蛋白轉錄因子。
　?。?）亞細胞定位分析表明GhWRKY23定位在細胞核中，推測該基因在細胞核中發(fā)揮一定的生物學功能。
　　（3）qRT-PCR分析棉花幼苗中GhWRKY23基因的表達模式，結果表明干旱、機械損傷和氧化脅迫能上調GhWRKY23的表達，而高鹽、青枯勞爾氏菌和立枯絲核菌則抑制它的表達。此

4、外，一些病程相關信號分子如SA、MeJA、ABA、ET在不同程度上誘導了GhWRKY23的表達。以上結果表明GhWRKY23能夠響應多種非生物和生物脅迫，并可能受多種信號分子的調節(jié)，初步推測其可能在防衛(wèi)反應中發(fā)揮重要作用。
　?。?）構建GhWRKY23正義植物表達載體，通過農(nóng)桿菌侵染的方法獲得穩(wěn)定表達的轉基因本生煙植株。對超表達植株的種子進行萌發(fā)實驗和根長統(tǒng)計，結果表明GhWRKY23對SA和ET敏感，對ABA有一定的抗性。推測

5、該基因能參與到SA、ABA和ET介導的信號轉導途徑中。
　?。?）GhWRKY23超表達植株離體葉片接種煙草青枯勞爾氏菌、丁香假單胞菌番茄致病變種和立枯絲核菌后，相對野生型植株表現(xiàn)出明顯的感病癥狀。DAB染色和臺盼藍染色結果進一步表明超表達植株中積累了更多ROS并產(chǎn)生了更多壞死組織，MDA含量測定結果說明超表達植株細胞膜損傷情況更嚴重。同時用MV模擬氧化脅迫，在轉基因的葉片中觀察到更多的活性氧積累。推測該基因可能在抵御病原菌侵染中

6、起到負調控作用，并可能參與到氧化脅迫響應中。
　?。?）利用qRT-PCR技術，對接種病原菌后前后SA、ABA、JA、ET信號通路中抗病相關基因及其他病程相關基因的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)超表達植株中的有些基因表達量較野生型植株有明顯的下調趨勢，推測GhWRKY23可能通過抑制SA、JA/ET信號途徑中相關基因的表達來負調控抗病反應。
　?。?）利用qRT-PCR分析病原菌侵染前后活性氧產(chǎn)生及清除相關基因的表達量，結果顯示超表達