極重度感音神經(jīng)性聾兒童致聾因素分析、常見基因檢測及其種族差異性研究.pdf

1、第一部分、極重度感音神經(jīng)性聾兒童的人工耳蝸植入術(shù)前評估及致聾危險(xiǎn)因素分析研究
　　 目的:對極重度感音神經(jīng)性聾患兒進(jìn)行術(shù)前全面評估以確保人工耳蝸植入適應(yīng)證的正確選擇及其術(shù)后康復(fù)效果;了解環(huán)境和遺傳因素在我國接受人工耳蝸植入群體中的比例。初步探討湖南地區(qū)極重度感音神經(jīng)性聾患兒的病因，為制定耳聾的預(yù)防計(jì)劃提供理論依據(jù)。
　　 方法:本研究對2005年11月至2011年4月到我院及湖南郴州湘南學(xué)院申請行人工耳蝸植入的386例極

2、重度感音神經(jīng)性耳聾患者進(jìn)行了回顧性調(diào)查，并進(jìn)行系統(tǒng)的全身體格檢查，聽力學(xué)檢查及影像學(xué)檢查等，進(jìn)行術(shù)前全面評估。對已知的耳聾的危險(xiǎn)因素在聾兒的分布情況進(jìn)行初步的探討，并對較常見的一些因素進(jìn)行多因素分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、我們的研究對象確診時(shí)間較晚，聾兒的平均疑診時(shí)間接近2歲左右，確診時(shí)間接近3歲。本研究中，386例耳聾兒童均存在言語障礙，僅有1例為語后聾。經(jīng)聽力篩查發(fā)現(xiàn)僅43例，因家人發(fā)現(xiàn)小兒聽力差而就診343例，

3、說明尚有較多小兒未接受聽力篩查。在接受人工耳蝸植入術(shù)前，386例聾兒中有231例驗(yàn)配助聽器。
　　 2、386例聾兒含已知的危險(xiǎn)因素共162人次，涉及114個(gè)聾兒，272人未查及已知的危險(xiǎn)因素，占70.5％:有耳聾家族史21人次;圍產(chǎn)期危險(xiǎn)因素共88人次;產(chǎn)前危險(xiǎn)因素共11人次;產(chǎn)后獲得性危險(xiǎn)因素共45人次。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知耳毒性藥物、家族史、缺氧、發(fā)育畸形、發(fā)熱抽搐及中耳炎可能引起和促進(jìn)極重度感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。而對危險(xiǎn)因素的

4、多因素分析表明，內(nèi)耳畸形（大前庭水管綜合癥，Mondini畸形，小耳蝸畸形及共同腔畸形）是最主要的危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論:
　　 1、在整個(gè)人工耳蝸植入過程中，術(shù)前患者的綜合評估是至關(guān)重要和必不可少的環(huán)節(jié)，其主要目的是從醫(yī)學(xué)、聽力學(xué)等多方面綜合評價(jià)和決定患者是否適合實(shí)施人工耳蝸植入手術(shù)。
　　 2、本研究證實(shí)了遺傳因素為極重度感音神經(jīng)性聾兒的主要危險(xiǎn)因素。對廣大人群普及自我保健及防聾治聾知識，加強(qiáng)孕前、產(chǎn)前致畸因

5、素的預(yù)防，預(yù)防及早期根治嬰幼兒期的中耳炎及發(fā)熱疾病;盡可能排除存在基因突變的遺傳學(xué)因素。進(jìn)行新生兒或兒童高危因素登記，對高危人群進(jìn)行聽力學(xué)篩查和隨診，并盡早干預(yù)，規(guī)范藥物使用，將有助于減少極重度耳聾的發(fā)生。
　　 第二部分、極重度感音性聾兒童常見致聾基因分析研究
　　 目的:對我國接受人工耳蝸植入群體進(jìn)行分子病因?qū)W研究;重點(diǎn)探討在接受人工耳蝸植入的病人中，GJB2，SLC26A4、線粒體12S rRNA基因突變發(fā)生的概率

6、、突變形式和突變熱點(diǎn)，探討適合中國人極重度感音神經(jīng)性聾的基因診斷策略。研究大前庭水管綜合征(Enlargedvestibular aqueduct syndrome，EVAS)在中國人極重度感音神經(jīng)性聾患者中的基因型和分子流行病學(xué)特點(diǎn)。比較基因芯片法和傳統(tǒng)測序法在基因診斷中的優(yōu)勢及差異。
　　 方法:采集236名接受和申請人工耳蝸植入的重度及極重度感音神經(jīng)性耳聾患者，30例EVAS患者和100例聽力檢測正常者的外周血。提取基因組

7、DNA,用耳聾基因芯片檢測四個(gè)國人中常見的耳聾相關(guān)基因中的9個(gè)熱點(diǎn)突變，包括GJB2(35delG，176del16bp，235delC及299delAT)，GJB3(538C＞T)，SLC26A4(IVS7-2A＞G、2168A＞G)和線粒體12S rRNA(1494C＞T及1555A＞G)。然后用傳統(tǒng)測序法對基因芯片檢測結(jié)果行驗(yàn)證，即對GJB2的編碼區(qū)，DNA12S rRNA(1494C＞T及1555A＞G)和SLC26A4基因的第

8、7和8外顯子，19號外顯子進(jìn)行測序。SLC26A4基因有21個(gè)外顯子，完全檢測較困難。為了進(jìn)一步明確致聾原因，我們對基因芯片檢測未發(fā)現(xiàn)突變或發(fā)現(xiàn)單雜合突變的大前庭水管綜合征患者進(jìn)一步行SLC26A4基因的DNA測序，先篩查第10、17、15、3外顯子，然后篩查剩余外顯子，直至發(fā)現(xiàn)另一個(gè)突變或篩查完全部SLC26A4外顯子。
　　 結(jié)果:經(jīng)測序，發(fā)現(xiàn)236例患者中93例攜帶有GJB2基因突變，發(fā)生率約35.36％。除3例純合235

9、delC被判讀為雜合外，測序方法同應(yīng)用基因芯片檢測的結(jié)果的結(jié)果一致，基因芯片的陽性突變檢出率為21.19％(50例)。兩種方法在陽性病人檢出率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而兩種方法對GJB2基因相關(guān)性耳聾（純合或復(fù)合雜合）的確診率為23.31％(55/236)和16.10％(38/236)，也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。236例患者GJB2致病等位基因頻率合計(jì)為31.36％(148/472)，共發(fā)現(xiàn)15種突變類型:5種常見多態(tài)性;8種已報(bào)道的致病突變;和2種

10、新突變類型。而其中235delC是最常見的致病突變類型，等位基因頻率為15.5％(75/472)，其次為109G＞A，等位基因頻率為10.8％(51/475)。新突變52A＞C，511-512insAACGC，各有一例以復(fù)合雜合的形式出現(xiàn)。在非綜合癥耳聾患者檢出一例223 C＞T——之前被認(rèn)為引起綜合癥性耳聾的突變。非綜合征型耳聾組40.55％(88/217)患者發(fā)現(xiàn)GJB2基因致病突變。而內(nèi)耳畸形組的GJB2基因等位基因突變率13.1

11、6％(5/38)，與正常聽力對照無顯著差異，說明GJB2基因突變不是內(nèi)耳畸形的主要病因，但也可能是重要致病影響因素，對其他的致病基因產(chǎn)生協(xié)同或疊加的作用。本研究發(fā)現(xiàn)236例患者12S rRNA致病基因1494C＞T及1555A＞G檢出率為分別為0.4％(1/236)及3.0％(7/236)。未發(fā)現(xiàn)GJB3(538C＞T)患者。而在236名極重度感音神經(jīng)性聾患者中，有21例(8.9％)檢測出SLC26A4基因異常，其基因型包括IVS7-2

12、A＞G純合1例，IVS7-2A＞G/2168 A＞G(H723R)復(fù)合雜合4例，IVS7-2A＞G單純雜合16例。30例EVAS患者組中，基因芯片方法共檢出SLC26A4基因突變25例，檢出率為83.33％。而傳統(tǒng)測序法中有28例患者檢測出了SLC26A4基因突變，檢出率為93.33％，與基因芯片法比較，檢出率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本實(shí)驗(yàn)中（包括CI組及EVAS組），我們共發(fā)現(xiàn)了16種突變類型，其中5種為新的突變類型(A227P，G36

13、8X，IVS8-1G＞T，IVS13+9C＞T和Q696X)。在所有的突變中，IVS7-2A＞G突變的發(fā)生率最高，其次為H723R和T410M。
　　 結(jié)論:耳聾基因芯片對GJB2(35delG，176del16bp，235delC及299delAT) SLC26A4(IVS7-2A＞G、2168A＞G)和線粒體12S rRNA1555A＞G檢出率高，能夠適用于一般的基因篩查。但對12S rRNA1494C＞T，GJB3(538

14、C＞T)檢出率低，與適用人群有關(guān)。根據(jù)基因芯片快速檢測后結(jié)果，并結(jié)合患者的臨床資料，并對相應(yīng)基因進(jìn)行測序驗(yàn)證或全序列分析才能很好地將基因芯片的快速、經(jīng)濟(jì)、高通量的優(yōu)勢與測序的高準(zhǔn)確性和高檢出率的優(yōu)勢相結(jié)合。
　　 第三部分、湖南苗族、土家族和漢族常見致聾基因的遺傳流行病學(xué)調(diào)查研究
　　 目的:遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，不同的地區(qū)和人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和突變熱點(diǎn)有很大的差異。目前GJB2基因、SLC26

15、A4基因、線粒體DNA12 SrRNA基因等常見耳聾基因在我國人群中的流行分布情況被廣泛研究，并取得了很大進(jìn)展，研究主要在漢族人群中進(jìn)行的，在少數(shù)民族耳聾人群中的耳聾基因分子流行病學(xué)研究較少。在本研究中，我們對湖南湘西少數(shù)民族地區(qū)的三個(gè)民族進(jìn)行常見耳聾基因的分子流行病學(xué)研究，以了解耳聾基因在我國少數(shù)民族地區(qū)和少數(shù)民族人群的流行分布情況，明確相應(yīng)突變譜和熱點(diǎn)突變，為聾病基因的大規(guī)模篩查提供依據(jù)。
　　 方法:本研究用基因芯片與傳統(tǒng)

16、測序方法聯(lián)合，在湖南湘西自治區(qū)漢族、苗族和土家族141例感音神經(jīng)性耳聾患者中進(jìn)行GJB2基因，線粒體DNA12S rRNA A1555G和SLC26A4基因突變分子流行病學(xué)調(diào)查，主要研究三個(gè)常見致聾突變在不同民族中攜帶率的差異。
　　 結(jié)果:在湖南地區(qū)正常聽力人群中檢測表明，苗族，土家族及漢族的GIB2基因突變等位基因頻率為苗族最高，漢族最低，土家族與漢族、苗族與漢族均具有顯著差別。三個(gè)民族間GJB2基因突變攜帶率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

17、三個(gè)民族的GJB2基因突變均以V37I，235delC為主。未檢測出35delG。提示湖南土家族和苗族的GJB2基因多態(tài)性分布與我國漢族相似，再次證實(shí)了三個(gè)民族有共同的人類種族起源。但在苗族和土家族正常聽力人群中V37I突變的等位基因頻率與攜帶率均較235delc高，與漢族正好相反。GJB2基因突變在各民族耳聾患者中有較高的攜帶率，土家族GIB2基因突變攜帶率及等位基因突變頻率均顯著性低于漢族患者。235delC突變是每個(gè)民族最常見的突

18、變方式，其次為V37I。235delC與V37I突變攜帶率及等位基因突變頻率在土家族最低，但三民族間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在土家族患者中檢測到三種新的突變類型223C＞T(R75W),257C＞G(T86R)及475G＞A(D159N)。223C＞T(R75W)雖被the connexin deafness homepage網(wǎng)站收錄，但在本研究中被認(rèn)為引起非綜合癥性耳聾而不是綜合性耳聾，因此也歸為新的遺傳突變。線粒體DNA12S rRNA A1

19、555G突變是該地區(qū)苗族和土家族人群常見的耳聾致病基因，均高于文獻(xiàn)報(bào)道的漢族中的A1555G突變率。這種現(xiàn)象主要與環(huán)境因素有關(guān)，特別是與湘西地區(qū)對氨基糖苷類抗生素的大量使用有關(guān)。苗族、土家族和漢族耳聾患者的SLC26A4IVS7-2A＞G，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未檢測出2168A＞G(H723R)突變?？梢奍VS7-2A＞G也是湘西苗族，土家族耳聾患者常見的SLC26A4基因致病突變。
　　 結(jié)論: GJB2基因突變在不同人群的分布相似

20、性及高發(fā)突變類型及攜帶率的差異性，既反映了湖南地區(qū)三個(gè)少數(shù)民族人群的遺傳同源性也顯示了種族的遺傳異質(zhì)性，與其起源和歷史原因等導(dǎo)致的長期人群聚集通婚及種族間的交流有關(guān)。
　　 第四部分、核基因GJB2與氨基糖苷類抗生素相關(guān)性聾關(guān)系的初步探討研究
　　 目的:有研究者發(fā)現(xiàn)存在核遺傳背景可能影響A1555G突變相關(guān)聽力喪失能否發(fā)生。而A1555G點(diǎn)突變的耳聾患者中，GJB2基因突變的攜帶率較高。在本研究中我們就核基因GJB2是

21、否與藥毒性耳聾相關(guān)，與A1555G是否存在關(guān)聯(lián)性，其表達(dá)是否會受到氨基糖苷類抗生素的影響進(jìn)行初步的探討，為藥物中毒性耳聾機(jī)制的探索以及防治尋求一個(gè)新的方向。
　　 方法:
　　 1、我們在攜帶mtDNA12S rRNA1555A＞G點(diǎn)突變的21例散發(fā)個(gè)家系中檢測GJB2基因突變的攜帶率，以明確GJB2突變與該類患者表型的關(guān)系。
　　 2、我們應(yīng)用免疫組化染色、western blot和real-time PCR的

22、方法觀察單次大劑量的慶大霉素注射的大鼠耳蝸外側(cè)壁不同時(shí)段Cx26表達(dá)的影響以及藥物中毒性聾大鼠耳蝸外側(cè)壁Cx26的表達(dá)，從而從分子水平探討藥毒性耳聾的發(fā)病機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1、我們在攜帶mtDNA12S rRNA1555A＞G點(diǎn)突變的多個(gè)家系中檢測GJB2基因突變的攜帶率，檢測到兩種GJB2基因突變109G＞A及79G>A+341A>G，其攜帶率較聽力正常并攜帶1555A>G的對照組家系成員高。同時(shí)攜帶GJB2

23、突變及1555A＞G突變的先證者其耳聾程度較無GJB2突變嚴(yán)重，這意味著雜合的GJB2突變可能促使1555A>G突變攜帶者其耳聾的發(fā)生。
　　 2、單次大劑量的靜脈注射慶大霉素可以快速的影響Cx26蛋白的表達(dá)和分布。但是Cx26蛋白水平的增加是一過性，而且與mRNA水平變化不一致。慶大霉素也引起Cx26 mRNA增加，但是增加的mRNA不能成功的翻譯成蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論:在1555A＞G攜帶者中GJB2基因突變攜帶率高

24、，且攜帶GJB2突變及1555A＞G突變的患者耳聾程度較重，GJB2基因也可能是氨基糖苷類抗生素的促進(jìn)因素。Cx26是慶大霉素作用后，尚未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)和耳蝸功能改變前最先發(fā)生改變的生物標(biāo)志物。在耳毒性聾的急性階段，Cx26的在耳蝸的重新分布和高表達(dá)可能增加內(nèi)淋巴鉀離子濃度及提高EP，很可能發(fā)揮了重要的拮抗機(jī)制，從而發(fā)揮一定的保護(hù)作用。本研究為氨基糖苷類抗生素引起的耳毒性聾的病理機(jī)制的研究和預(yù)防提供了一個(gè)新的方向。氨基糖苷類如何調(diào)節(jié)C