APOBEC3G在胰腺癌中分子機(jī)制及其關(guān)鍵靶蛋白研究.pdf

1、目的:
　　胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率居第4位，發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、早期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，但治療手段有限。闡明胰腺癌分子機(jī)制是治療胰腺癌的基礎(chǔ)和前提。近年研究提示病毒感染與消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，然病毒感染對(duì)腫瘤惡性生物學(xué)行為影響尚不明了。APOBEC酶作為一種常見的病毒感染反應(yīng)性蛋白，能使病毒DNA發(fā)生超突變，具有廣譜抗病毒能力。近來研究提示APOBEC蛋白不僅有抗病毒作用，而且在腫瘤中也有重要功能。本研究目的是通過篩選和鑒

2、定參與腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的APOBEC家族成員;檢測(cè)APOBEC3G(A3G)在胰腺癌中的表達(dá)改變;改變A3G表達(dá)水平對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分子機(jī)制，以及鑒定其關(guān)鍵作用靶蛋白，從而明確A3G對(duì)胰腺癌惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　采用全基因eDNA表達(dá)譜芯片篩選參與腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的病毒相關(guān)蛋白。為探討A3G在胰腺癌表達(dá)情況，采用Real-time PCR檢測(cè)3株胰腺癌細(xì)胞系，11例配對(duì)胰腺癌及癌旁組

3、織中A3G mRNA水平;采用免疫組化和免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證54例配對(duì)胰腺癌病理組織切片中A3G蛋白的表達(dá)情況。為評(píng)價(jià)A3G在胰腺癌中的作用，建立了穩(wěn)定表達(dá)A3G的胰腺癌細(xì)胞系，并觀察過表達(dá)A3G對(duì)裸鼠皮下移植瘤形成情況的影響。為研究A3G早期促進(jìn)成瘤的分子機(jī)制，采用克隆球形成試驗(yàn)、失巢凋亡(anoikis)實(shí)驗(yàn)和流式檢測(cè)早期凋亡水平，并用western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究A3G抑制anoikis的分子機(jī)制，我

4、們檢測(cè)了Akt通路活性，western blot檢測(cè)了Akt通路中關(guān)鍵抑制蛋白PTEN的表達(dá)，并用免疫共沉淀方法檢測(cè)A3G與PTEN的相互作用。同時(shí)采用熒光素酶雙報(bào)告基因方法檢測(cè)了Wnt通路活性，用免疫共沉淀篩選作用于Wnt通路的關(guān)鍵蛋白。我們進(jìn)一步構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)域突變體分析A3G與PTEN、FZD蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)病毒感染反應(yīng)性蛋白A3G可能參與腫瘤惡性生物學(xué)行為;A3G在胰腺癌細(xì)胞和組織中表

5、達(dá)升高;高表達(dá)A3G早期可促進(jìn)動(dòng)物移植瘤的成瘤，晚期又能抑制腫瘤生長(zhǎng);體外研究發(fā)現(xiàn)A3G增加了抗凋亡蛋白Bcl-2，Mcl-1和phospho-Bcl-2的表達(dá)，顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的anoikis;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)A3G是通過激活A(yù)kt激酶活性從而參與anoikis抵抗，A3G激活A(yù)kt通路是通過滅活PTEN蛋白活性實(shí)現(xiàn)的，A3G與PTEN結(jié)合需要A3G的CD2結(jié)構(gòu)域存在，PTEN與A3G結(jié)合需要PTEN的C2結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域的存在