縮小型抗金黃色葡萄球菌靶向工程多肽.pdf

1、由于抗生素的濫用和耐藥菌株的不斷出現(xiàn),特別是耐甲氧西林和耐萬霉素金黃色葡萄球菌的出現(xiàn),使人類對金黃色葡萄球菌感染的控制受到了嚴(yán)重的挑戰(zhàn),因此在合理使用抗生素的同時(shí)更要發(fā)展新型的抗生素.而組裝出滿足人類需要的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)機(jī)器是二十一世紀(jì)分子生物學(xué)工作的前沿之一.大腸菌素Ia是可形成離子通道的一種細(xì)菌素,其通道結(jié)構(gòu)域(D451—I626)能在同種異株的大腸桿菌內(nèi)膜上形成致死性離子通道.然而由于其信號識別結(jié)構(gòu)域只能識別大腸桿菌內(nèi)膜上形成致死

2、性離子通道.然而由于其信號識別結(jié)構(gòu)域只能識別大腸桿菌外膜和內(nèi)膜上的特異受體,因此野生型大腸菌素難以拓展成為對抗它種細(xì)菌的抗菌素.上世紀(jì)九十年代人們逐步確定了革蘭氏陽性菌分泌的調(diào)節(jié)同種細(xì)菌生長和毒素產(chǎn)生的信息素多是由數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,具有自主尋找同種菌胞膜受體的生物學(xué)活性.丘小慶等利用信息素的自主導(dǎo)向特性和大腸菌素Ia的致死性通道特性構(gòu)建了由金黃色葡萄球菌信息素AgrD和大腸菌素Ia組成的融合蛋白,命名為Pheromoni

3、cin,該蛋白表現(xiàn)出了信息素和大腸菌素Ia都不具有的抗金黃色葡萄球菌活性.但這樣的融合蛋白尚有大腸菌素Ia兩個(gè)與抗金黃色葡萄球菌活性無關(guān)的信號識別結(jié)構(gòu)域,從理論上講還不屬于純粹的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)分子機(jī)器,因而該研究將進(jìn)一步裁減掉大腸菌素Ia的非通道形成肽鏈,利用大腸菌素Ia的水性孔道結(jié)構(gòu)域(K544—I626)和金黃色葡萄球菌信息素AgrD構(gòu)建結(jié)構(gòu)上更緊湊的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)分子機(jī)器(Engineered multidomain protei

4、n machine).利用點(diǎn)突變方法將金黃色葡萄球菌信息素AgrD(Ⅰ型,YSTCDFIM)的基因引入到大腸菌素Ia羧基端I626基因上,并將限制性內(nèi)切酶SacⅠ酶切位點(diǎn)基因分別引入到大腸菌素Ia的P4和K544上,通過酶切、膠回收、連接獲得含大腸菌素Ia水性孔道結(jié)構(gòu)域和金黃色葡萄球菌信息素AgrD基因的重組質(zhì)粒.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1工程菌中,生產(chǎn)構(gòu)建的工程多肽,離子交換純化后獲得工程多肽初步純化產(chǎn)物,體外抗菌試驗(yàn)、藥物撤離試

5、驗(yàn)檢測工程多肽的抗菌活性,在人工脂質(zhì)膜上測定其形成離子通道的特性以初步研究抗菌機(jī)理,并觀察其對真核細(xì)胞的毒性作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:縮小型抗金黃色葡萄球菌靶向人工多肽能在金黃色葡萄球菌信息素AgrD的誘導(dǎo)下,在其細(xì)胞膜上形成致死性離子通道,因而具有抗金黃色葡萄球菌的生物活性,對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性,因而該工程多肽極具發(fā)展成為抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物的潛在價(jià)值,同時(shí)它也是將兩個(gè)來自不同種源蛋白質(zhì),生物活性截然不同