飼用堿性β-甘露聚糖酶和植酸酶的異源表達(dá)研究.pdf

1、β-甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中。微生物β-甘露聚糖酶是β-1.4-D-甘露聚糖(β-1.4-D-mannanmannanohydrolase,EC.3.2.1.78)的簡(jiǎn)稱，是一個(gè)被研究相對(duì)較晚的酶類。MaY等[1]報(bào)道嗜堿芽孢桿菌N16-5(Bacillussp.N16-5)的堿性甘露聚糖酶的核酸序列和酶學(xué)性質(zhì)。在本研究中，將該基因和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭誘導(dǎo)型質(zhì)粒pDG148-Stu構(gòu)建成重組質(zhì)粒pDG-man，然后將重組質(zhì)

2、粒分別導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，在大腸桿菌JM109中經(jīng)0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后酶活可達(dá)4.5U/mL。相同條件下，重組大腸桿菌DE3-RIL(pDG-man)表達(dá)堿性β-甘露聚糖酶水平接近大腸桿菌JM109(pDG-man)的2倍。該基因在枯草芽孢桿菌中得到了分泌表達(dá)。在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后可以表達(dá)19.2U/mL堿性β-甘露聚糖酶。 為了

3、繼續(xù)對(duì)堿性β-甘露聚糖酶進(jìn)行高表達(dá)研究，試驗(yàn)采用了芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基來進(jìn)行產(chǎn)酶研究，初步誘導(dǎo)酶活達(dá)到29.32U/mL，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，該重組枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶水平有了大幅度的提高，最高可達(dá)110.02U/mL。 實(shí)驗(yàn)表明重組枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)周期為5天(其中4天為誘導(dǎo)產(chǎn)酶期)，此后酶量不再增加，酶活保持穩(wěn)定，恒定在一個(gè)最高水平，在之后的2天內(nèi)下降幅度不超過5％。產(chǎn)酶過程中葡萄糖和豆餅粉加量對(duì)酶活影響很大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

4、最佳葡萄糖加量為20g/L，最佳豆餅粉加量為80g/L。另外搖瓶裝液量對(duì)重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶的影響很大，試驗(yàn)結(jié)果顯示500mL的搖瓶裝量50mL時(shí)酶活水平最高。說明重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶對(duì)氧的需求很大。 植酸酶方面，在本研究中亞克隆了粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)的植酸酶基因(來自于重組質(zhì)粒pPIC9K-phy)，將其分別與pET-28a和pBL-WZX構(gòu)成重組質(zhì)粒pBL-phy和pET-phy