16595.β甘露聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、THECLONINGANDEXPRESSIONOFflMANNANASEGENEANDITSRECOMBINEDENZYMATICPROPERTIESADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNonTlalUniversitvinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByFluWenboSupe

2、rvisor：ProfZhangJianxinMay，2012摘要類(lèi)芽孢桿菌cH3(Paenibacilh“spCH一3)是本實(shí)驗(yàn)室從刺槐種子中篩選分離到的一株植物內(nèi)生菌，具有較強(qiáng)的蟑甘露聚糖酶活性，采用簡(jiǎn)并PCR和1AILPCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)技術(shù)從該菌基因組DNA中克隆得蓼臟甘露聚糖酶基因(marA)。序列分析表明，該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)為984bp，編碼一個(gè)含有327個(gè)氨基酸、等

3、電點(diǎn)為701、理論分子量約為35270KDa的蛋白，N端前32個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽。同源性分析顯示t該酶氨基酸序列與來(lái)源于PaenibacillusspA1MANAI的氨基酸序列同源性高達(dá)8135％，屬于糖苷水解酶5家族(GH5)的一員。通過(guò)對(duì)該酶分子三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析，該酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)由14個(gè)a螺旋和15個(gè)口折疊股構(gòu)成，其催化域采用一定的折疊方式形成TIM桶狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)表達(dá)載體pET32a()或pET28a()的多克隆位點(diǎn)及目的基因序列特

4、點(diǎn)。選擇BamH，和Sal，酶切位點(diǎn)處作為目的基因的插入位置。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETmanA，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)獲得了此酶的高效表達(dá)。對(duì)重組聲一甘露聚糖酶酶活力進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果顯示，酶活力可達(dá)9034U／ml。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳分析，蛋白圖譜顯示1條大約為504KDa(pET28a表達(dá)系為394KDa)的特異性條帶。實(shí)驗(yàn)探討了溫度、誘導(dǎo)物(IPTG)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間三種單因素對(duì)重組肛甘

5、露聚糖酶基因工程菌產(chǎn)酶的影響，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交組合試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該菌搖瓶發(fā)酵的最佳條件組合為：發(fā)酵溫度28℃，IPTG005mM，誘導(dǎo)時(shí)間12h，且在此發(fā)酵條件下，酶活力可達(dá)105417U／mL，比初始酶活提高了約107倍。各因素對(duì)該菌產(chǎn)酶的影響大小依次為誘導(dǎo)物(IPTG)濃度誘導(dǎo)時(shí)間瓦作項(xiàng)(溫度IPTG濃度))溫度。50L發(fā)酵罐中進(jìn)行該茁擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，在添加誘導(dǎo)物(廿TG)2h后肛甘露聚糖酶的活力就已達(dá)到較高水平，誘