β--甘露聚糖酶基因的克隆表達(dá)及分子改造.pdf

1、甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是內(nèi)切β-1，4-甘露聚糖糖苷水解酶的簡稱，屬于半纖維素酶，能夠隨機(jī)水解甘露聚糖分子主鏈中的β-1，4-D-甘露糖苷鍵，在植物、動(dòng)物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)，目前廣泛應(yīng)用于在食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、紙漿漂白及能源開發(fā)等領(lǐng)域。其中微生物來源的β-甘露聚糖酶具有提取方便、成本低、活性高和來源穩(wěn)定等顯著特點(diǎn)因而引起了人們廣泛關(guān)注。
　　本研究從采集的土壤樣品中成功篩選到一株產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株Bacillus

2、sp.MK-2，并對菌株進(jìn)行了鑒定，甘露聚糖酶基因的克隆表達(dá)和蛋白分子改造等研究。
　　1.以魔芋粉為唯一的碳源，通過連續(xù)的富集培養(yǎng)，結(jié)合剛果紅平板篩選和DNS法酶活檢測等手段，成功分離出一株產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株MK-2，其在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24h后達(dá)到產(chǎn)酶高峰173.71 U/mL。提取菌株MK-2的基因組，以27F/1492R為引物，擴(kuò)增其16S rDNA序列，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對后，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株初步鑒定為芽

3、孢桿菌屬(Bacillus sp.)，實(shí)驗(yàn)室編號為Bacillus sp.MK-2。
　　2.通過設(shè)計(jì)特異性引物，成功擴(kuò)增出含有完整ORF（開放式閱讀框）的甘露聚糖酶基因序列。序列分析表明:該基因全長為1104bp，包含完整的β-甘露聚糖酶基因編碼序列，編碼367個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，并將其命名為man。該基因編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量是41.44 kDa，等電點(diǎn)為5.76。通過SignalP(http://www.cbs.dt

4、u.dk-dk/services/SignalP)預(yù)測其N段前31個(gè)氨基酸為信號肽。對蛋白功能進(jìn)行分析得知，該蛋白由一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域組成，不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且該蛋白屬于糖苷水解酶26家族。
　　利用載體pP43NMK表達(dá)外源蛋白，將重組表達(dá)載體pP43-man轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌WB800中，以Superrich培養(yǎng)基作為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，37℃，220rpm實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵6天達(dá)到最高酶活2852 U/mL。重組酶蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀、鎳

5、柱親和層析和透析等處理后，獲得甘露聚糖酶的純蛋白，測其比活力為2802U/mg。
　　重組酶的酶學(xué)評價(jià)表明，酶的最適溫度和pH為55℃和6.0，40℃處理，重組甘露聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性，甘露聚糖酶在pH6.0-7.0時(shí)具有一定的耐受性，pH過高或過低，酶活力耐受性都較差，這在一定上限制了其應(yīng)用范圍。酶促動(dòng)力學(xué)分析，其米氏常數(shù)Km為4.5 mg/mL，Vmax為5000μmol·min-1·mg-1;底物特異性分析表明，該甘露聚

6、糖酶底物專一性較好;在金屬離子對酶的影響方面，Zn2+和Ni2+對甘露聚糖酶具有很強(qiáng)的抑制作用，Ag+對甘露聚糖酶具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　3.利用易錯(cuò)PCR手段，以載體pP43NMK為表達(dá)載體，芽孢桿菌WB800為宿主，構(gòu)建β-甘露聚糖酶基因的突變體表達(dá)文庫，以高通量的篩選手段，從3752株突變體中篩選出3株酶表達(dá)活力明顯提高的菌株WBMAN-8，WBMAN-14，WBMAN-52，酶活力分別為9747 U/mL，11848 U