麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與細(xì)胞周期同步化研究.pdf

1、本文以麋鹿的耳尖皮膚組織為材料進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代、冷凍保存、解凍復(fù)蘇和部分生物學(xué)特性的鑒定；用不同匯合程度、血清饑餓不同時(shí)間以及含羞草酸不同劑量和時(shí)間對(duì)糜鹿皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行同步化處理后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期同步化的效果，豐富麋鹿研究的內(nèi)容。為組織工程研究提供借鑒資料，為麋鹿的基礎(chǔ)研究和保護(hù)瀕危珍稀動(dòng)物資源提供基礎(chǔ)資料。研究結(jié)果如下： 1 麋鹿耳皮膚成纖維細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng) 本試驗(yàn)采用組織塊

2、法進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得麋鹿成纖維細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代得以純化。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)冷凍保存，得到麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞系．F4代生長(zhǎng)曲線中，第5 d群體倍增值為5.50，群體倍增時(shí)間為39.03 h，第6 d細(xì)胞生長(zhǎng)減慢；由分裂曲線看出，分裂指數(shù)最高時(shí)期是在培養(yǎng)的第5 d，第6 d急劇下降,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與分裂指數(shù)表明，麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下存在早期生長(zhǎng)延緩和晚期生長(zhǎng)抑制，屬于正常的體細(xì)胞。麋鹿染色體教目為2n=68，核型式為2(M)＋6

3、4(A)，XY(A，M)。血清濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有影響，10％和15％NCS組有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末凋亡和死亡的細(xì)胞數(shù)較多，20％NCS組沒(méi)有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并且細(xì)胞數(shù)目少于10％和15％NCS組，因此細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中采用10％NCS，每3 d換一次液，在發(fā)生密度抑制和接觸抑制前就進(jìn)行傳代，避免營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝物積累。細(xì)胞冷凍時(shí)采用10％DMSO作冷凍保護(hù)劑，冷凍時(shí)先在4℃放置30 min，移入-20℃放置1.5 h，再在液氮

4、面上方懸吊7～8 h后投入液氮，復(fù)蘇后可獲得87.78％的貼壁率。 2 麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化研究：為了了解麋鹿細(xì)胞周期調(diào)控的特點(diǎn)，本試驗(yàn)對(duì)麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同匯合程度、血清饑餓不同時(shí)間以及含羞草酸(mimosine)不同劑量和時(shí)間的處理，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果表明，100％匯合1d的細(xì)胞GO/Gl期比例可達(dá)91.95％，但是匯合2d后繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA片段化和細(xì)胞的異常聚集。血清饑餓能夠迅速地改變麋鹿皮膚

5、成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)，使GO/G1期細(xì)胞比例升高，G2/M期細(xì)胞比例降低，血清饑餓處理24h后有89.42％的細(xì)胞處于GO/GL期,當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)144h后細(xì)胞凋亡和異常聚集的比例會(huì)增加。適宜劑量的含羞草酸能夠使麋鹿成纖維細(xì)胞達(dá)到同步化的目的，但效果低于接觸抑制和血清饑餓,并且也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。 本研究的創(chuàng)新之處在于豐富了麋鹿研究的基礎(chǔ)資料。麋鹿有“活化石”之稱，但目前對(duì)麋鹿的基礎(chǔ)研究在許多方面仍是空白，本試驗(yàn)建立麇鹿皮膚