皮膚成纖維細(xì)胞中dystrophin基因的表達(dá)研究.pdf

1、目的： 研究皮膚成纖維細(xì)胞中dystrophin mRNA和dystrophin的表達(dá)，探索應(yīng)用皮膚成纖維細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化有遺傳缺陷肌細(xì)胞研究時(shí)供體的可行性。 方法： 1、組織塊法體外培養(yǎng)0～1日齡正常小白鼠皮膚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞爬滿培養(yǎng)皿后除去組織塊，用0.25％胰酶消化處理，按1：3傳代。然后通過RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)的小白鼠原代及第1～4代皮膚成纖維細(xì)胞中dystrophin

2、mRNA及dystrophin的表達(dá)。 2、將小白鼠骨骼肌、心臟、肝臟、腎臟和皮膚組織剪碎后放入液氮中研磨，然后加裂解液勻漿，最后通過RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)小白鼠各組織中dystrophin mRNA及dystrophin的表達(dá)。 3、將小白鼠骨骼肌和皮膚組織剪碎放入液氮凍后再碾磨成細(xì)顆粒狀，加入裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，最后通過PCR檢測(cè)確認(rèn)小白鼠皮膚成纖維細(xì)胞基因組DNA中含有dystr

3、ophin基因。 結(jié)果： 1、RT-PCR結(jié)果： （1）細(xì)胞水平上檢測(cè)：小白鼠骨骼肌（陽性對(duì)照）經(jīng)擴(kuò)增，產(chǎn)物呈573bp的特異性DNA條帶，而經(jīng)培養(yǎng)的小白鼠原代及第1～4代皮膚成纖維細(xì)胞均沒有擴(kuò)增到任何條帶。 （2）組織水平上檢測(cè)：小白鼠骨骼肌和心肌經(jīng)擴(kuò)增，產(chǎn)物呈573bp的特異性DNA條帶，而小白鼠皮膚、肝臟和腎臟組織均未擴(kuò)增到任何條帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明dystrophin mRNA在皮膚成纖維細(xì)

4、胞中無表達(dá)。 2、Western blot結(jié)果： （1）細(xì)胞水平上檢測(cè)：小白鼠骨骼?。栃詫?duì)照）出現(xiàn)了約427KD的特異性條帶，而小白鼠原代及第1～4代皮膚成纖維細(xì)胞均沒有出現(xiàn)反應(yīng)條帶。 （2）組織水平上檢測(cè)：小白鼠骨骼肌和心肌均出現(xiàn)了約427KD的特異性條帶，而小白鼠皮膚、肝臟和腎臟組織均未出現(xiàn)反應(yīng)條帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明dystrophin在皮膚成纖維細(xì)胞中無表達(dá)。 3、PCR結(jié)果： 小白