百草枯致肺損傷過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HIF-1α的影響.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)是全球廣泛使用的除草劑，人畜中毒后死亡率極高。肺是其作用的主要靶器官，百草枯中毒后迅速蓄積于肺內(nèi)，肺內(nèi)百草枯濃度是血漿中的6到10倍，百草枯可以迅速破壞肺的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，引起肺出血、水腫，最終引起肺纖維化，患者最終死于肺纖維化。到目前為止，百草枯中毒沒有特殊解毒藥物，治療措施有限，患者病死率高達(dá)60％~80%。因此深入探討百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。
　　缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypox

2、ia-induced factor-1α，HIF-1α）通過多種途徑調(diào)節(jié)人體許多組織(肝臟、腎臟、心臟)的纖維化過程，在百草枯中毒，缺氧誘導(dǎo)因子1α的高表達(dá)與肺纖維化關(guān)系密切，因此研究缺氧誘導(dǎo)因子1α的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。既往研究顯示，低氧是上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α的主要因素，然而我們前期工作發(fā)現(xiàn)百草枯中毒2h后大鼠肺組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)明顯增高，而低氧則發(fā)生在中毒后6h。因此，我們推測(cè)在百草枯中毒中，缺氧誘導(dǎo)因子1α的上調(diào)并不是

3、通過缺氧誘導(dǎo)的，那么缺氧誘導(dǎo)因子1α的高表達(dá)是如何實(shí)現(xiàn)的。研究證實(shí)在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的肺損傷中，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可以明顯的抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)，而低濃度的百草枯刺激可以引起肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，表現(xiàn)為分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78）、糖調(diào)節(jié)蛋白94（gluco

4、se-regulated protein94，GRP94）增加。為了探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)參與肺纖維化及其可能的分子機(jī)制，本課題進(jìn)行了以下研究。
　　目的：
　　缺氧誘導(dǎo)因子1α在百草枯致肺纖維化中發(fā)揮重要的作用，但是其上游調(diào)控因子尚不清楚，因此本研究分別從體內(nèi)體外研究探討在百草枯中毒中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的可能機(jī)制。
　　因子尚不清楚，因此本研究分別從體內(nèi)體外研究探討在百草枯

5、中毒中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.百草枯中毒動(dòng)物模型建立
　　將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）、染毒組（50只）。對(duì)照組采用生理鹽水（1 ml）一次性灌胃；染毒組按照50 mg/kg的20%的百草枯溶液一次性灌胃（生理鹽水稀釋至1 ml）。灌胃后按照24 h,48 h,72 h,96 h,168 h分組，每組10只大鼠，采集肺組織標(biāo)本。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：

6、
　?。?）制備百草枯中毒大鼠模型，收集不同時(shí)間點(diǎn)的肺組織標(biāo)本；蘇木素-伊紅(hymatoxylin and eosin，HE)和Masson染色評(píng)估肺組織病理學(xué)改變；免疫組化和Western Blot檢測(cè)肺組織中糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）、X-盒結(jié)合蛋白1（X box-binding protein1，XBP-1）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)水平。
　　（2）制備百草

7、枯中毒大鼠模型，采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸預(yù)處理動(dòng)物；免疫組化和Western Blot檢測(cè)肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物、缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)：
　?。?）制備百草枯中毒體外模型，采用不同濃度的百草枯處理人肺癌細(xì)胞A549、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN細(xì)胞不同時(shí)間，篩選出百草枯處理的濃度及時(shí)間；采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖調(diào)節(jié)蛋白78、X-盒結(jié)合蛋白1和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)。

8、>　?。?）制備百草枯中毒體外模型，采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸給予預(yù)處理，采用Western Blot檢測(cè)人肺癌細(xì)胞A549、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN細(xì)胞內(nèi)糖調(diào)節(jié)蛋白78、X-盒結(jié)合蛋白1和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)。
　?。?）制備百草枯中毒體外模型，采用GRP78-siRNA技術(shù)處理人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中糖調(diào)節(jié)蛋

9、白78、X-盒結(jié)合蛋白1和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)NF-κB家族成員p65蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. HE結(jié)果顯示百草枯中毒后大鼠肺組織出現(xiàn)急性彌漫性損害，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增厚。隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)，炎性細(xì)胞大量增加，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)彌漫性肺出血，甚至結(jié)構(gòu)消失。
　　2. Masson染色結(jié)果表明正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常；百草枯染毒組可以看見藍(lán)染的膠原纖維，胞質(zhì)和紅細(xì)胞呈紅色，

10、細(xì)胞核被染成藍(lán)褐色，并且隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，藍(lán)染的膠原纖維增多。
　　3. Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示百草枯中毒后，大鼠肺組織和人肺癌細(xì)胞A549、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN細(xì)胞內(nèi)糖調(diào)節(jié)蛋白78、X-盒結(jié)合蛋白1和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)明顯增高。
　　4.采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸可以明顯抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，這一結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在百草枯上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)中發(fā)揮重要的作用。