百草枯致肺損傷中肌成纖維細(xì)胞的骨髓源性研究.pdf

1、背景和目的：百草枯對(duì)人畜具有高毒性，口服中毒主要吸收、聚集于肺部，引起急性肺部炎癥反應(yīng)，啟動(dòng)不可逆性的肺纖維化過(guò)程，最終導(dǎo)致大部分患者于數(shù)周內(nèi)死亡。肌成纖維細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子和合成細(xì)胞外基質(zhì)的雙重作用，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及后者的持續(xù)存在是肺纖維化發(fā)生進(jìn)展的關(guān)鍵。目前關(guān)于肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源尚無(wú)定論，本研究探討肌成纖維細(xì)胞是否源于骨髓，以及是否在百草枯致肺損傷中發(fā)揮作用，以期為百草枯的治療提供新的治療思路。 方法：以

2、密度梯度離心法分離近交系雄性：f344大鼠外周血循環(huán)成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)10～12天，檢測(cè)細(xì)胞活力并用DAPI熒光染料標(biāo)記。將30只SPF級(jí)近交系雄性f344大鼠隨機(jī)分為百草枯中毒組和正常對(duì)照組，一次性灌胃80mg/kg百草枯或等量生理鹽水制備百草枯中毒模型或正常對(duì)照組。造模后經(jīng)鼠尾靜脈注入DAPI標(biāo)記的循環(huán)成纖維細(xì)胞，分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)輸后1天、7天和14天時(shí)處死，每次5只。取肺組織固定后行HE染色觀察病理變化，測(cè)量肺泡間隔面積，采用免疫組化染

3、色檢測(cè)肺組織內(nèi)α-SMA和CD<,34>的表達(dá)，采用免疫熒光染色檢測(cè)肺內(nèi)DAPI藍(lán)色熒光表達(dá)。 結(jié)果：①外周血循環(huán)成纖維細(xì)胞分離成功，生長(zhǎng)良好，轉(zhuǎn)輸前活細(xì)胞率90％以上。②百草枯中毒組大鼠肺組織HE染色可見(jiàn)進(jìn)行性肺損傷，肺間質(zhì)充血水腫，肺泡腔內(nèi)炎性滲出，成纖維細(xì)胞增生及肺泡間隔增寬，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)其肺組織肺泡間隔面積均明顯增大，與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=-0.000；P=-0.000；P=0.046)。③在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，百

4、草枯中毒組α-SMA表達(dá)均高于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.012；P=-0.000；P=-0.000)；三個(gè)時(shí)間點(diǎn)百草枯中毒組α-SMA表達(dá)進(jìn)行性增強(qiáng)，三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.009)。④在各時(shí)間點(diǎn)，百草枯中毒組CD<,34>表達(dá)強(qiáng)度均高于正常對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=-0.446；P=-0.326；P=0.594)；三個(gè)時(shí)間點(diǎn)百草枯中毒組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.757)。⑤百草枯中毒組肺切片熒光顯色可見(jiàn)有較明亮

5、的藍(lán)色熒光，早期多聚集于血管周圍，后期可見(jiàn)肺間質(zhì)內(nèi)表達(dá)；正常對(duì)照組藍(lán)色熒光微弱或不可見(jiàn)。 結(jié)論：采用80mg/kg中毒量灌胃制備百草枯中毒致肺損傷模型成功，給藥方式和劑量選擇合適。隨時(shí)間不同百草枯中毒大鼠肺組織切片顯示為肺泡炎和纖維化改變。應(yīng)用密度梯度離心法成功從外周血中分離出成纖維細(xì)胞，所得循環(huán)成纖維細(xì)胞能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)，并用于體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)。：DAPI可有效標(biāo)記細(xì)胞，易于操作，標(biāo)記率高。采用DAPI標(biāo)記的循環(huán)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)輸