用PCR法快速定量人類糞便中雙歧桿菌的研究.pdf

1、目的:人類腸道擁有大量活躍、復雜的菌群,其中約占正常成人腸道菌群3﹪,嬰兒腸道菌群75﹪-91﹪的雙歧桿菌是一種重要的維持腸道微生態(tài)平衡的生理菌,具有預防腹瀉與腸道感染、緩解便秘、免疫調(diào)節(jié)的作用,<'[1,2]>快速準確定量人類糞便中的雙歧桿菌對于分析腸道復雜菌群的結(jié)構(gòu),配合臨床檢驗指導臨床用藥,保持腸道菌群動態(tài)平衡,維持健康預防疾病具有重要意義.目前國內(nèi)外對于腸道中雙歧桿菌的定量采用的對糞便標本進行稀釋滴種法分離計數(shù),費時費力;在提取

2、DNA基礎(chǔ)上建立的普通PCR法只能定性和地定量,<'[3]>DNA提取步驟繁瑣且DNA提取中用到的酚、蛋白酶K等試劑易抑制PCR擴增,<'[4]>影響雙歧桿菌的定量.該實驗的目的是將糞便離心、洗滌處理后,不經(jīng)過分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,用real-time PCR建立快速、準確從糞便標本中定量雙歧桿菌.方法:實驗分為二部分:第一部分用普通PCR法定量人類糞便中雙歧桿菌.根據(jù)16SrRNA基因設計雙歧桿菌屬特異引物,將糞便離心、洗滌處

3、理后,不經(jīng)過分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,用普通PCR法從糞便標本中半定量雙歧桿菌.并且比較普通PCR定量的雙歧桿菌結(jié)果和傳統(tǒng)稀釋滴種法定量的雙歧桿菌結(jié)果的相關(guān)性.第二部分用real-time PCR法定量人類糞便中雙歧桿菌.利用相同的雙歧桿菌屬特異引物,將糞便離心、洗滌處理后,不經(jīng)過分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,但經(jīng)過系列稀釋糞便后用real-time PCR定量雙歧桿菌.并且比較real-time PCR定量的雙歧桿菌結(jié)果和傳統(tǒng)稀釋