紫杉醇聯(lián)合紫草素對U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制初探.pdf

1、前言：
　　腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率、低治愈率等特點(diǎn)。近年來，化學(xué)治療已經(jīng)成為腦膠質(zhì)瘤特別是惡性腦膠質(zhì)瘤患者的主要治療方式。如今化療廣泛應(yīng)用于臨床治療，然而單一藥物的應(yīng)用常出現(xiàn)腫瘤耐藥等現(xiàn)象，故化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用已成為一種趨勢。
　　紫杉醇提取自從紫衫樹皮并作用于微管蛋白。它可加速微管二聚體形成微管，并防止其分離并抑制細(xì)胞的正常分裂;同時抑制其他因素對微管系統(tǒng)的作用，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2、。紫杉醇對多種腫瘤具有很好的療效，尤其針對耐藥性的腫瘤也取得了較好的進(jìn)展。研究表明，ERK信號通路可促進(jìn)細(xì)胞的分化與增殖，紫杉醇通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而起抗癌作用的途徑可能與之相關(guān)。
　　紫草素作為傳統(tǒng)中藥材紫草的主要有效成分，已被證明具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力等作用。紫草素類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制主要包括誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡、壞死，抑制蛋白酪氨酸激酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶，同時通過影響腫瘤細(xì)胞的信號通路達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。
　　紫杉

3、醇和紫草素均為穩(wěn)定、高效的化療藥物，可通過對腫瘤細(xì)胞周期的阻滯及促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤生長、遷移及侵襲的作用。研究證實(shí)，紫杉醇和紫草素可分別增加及抑制p-ERK蛋白的表達(dá)。本研究的目的旨在首先探討是否可以通過應(yīng)用紫草素來抑制紫杉醇對p-ERK蛋白表達(dá)的上調(diào)，從而提高紫杉醇的化療效果，進(jìn)一步研究是否可以通過兩者的聯(lián)用實(shí)現(xiàn)化療藥物的協(xié)同作用，產(chǎn)生更好的抗癌效果，這為今后紫杉醇治療膠質(zhì)瘤及化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　

4、　實(shí)驗(yàn)材料和方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)細(xì)胞株
　　人U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
　?。ǘ┲饕噭?br>　　紫草素（中國藥品生物制品檢定所）;CCK-8（北京鼎國生物科技有限公司），DMSO，紫杉醇（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）;胎牛血清（北京鼎國生物科技有限公司）;Annexin Ⅴ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有

5、限公司）;細(xì)胞周期檢測試劑盒（北京鼎國生物科技有限公司）;小鼠抗p-ERK單克隆抗體，兔抗總ERK單克隆抗體（Abcam公司）;山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗，山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的IgG二抗。
　?。ㄈ┲饕獌x器
　　細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;臺式低溫超速離心機(jī)（德國Sigma公司）;聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;轉(zhuǎn)印儀（北京市六一儀

6、器廠）;Las3000成像系統(tǒng)（日本FUJIFILM公司）;凝膠成像分析軟件（江蘇捷達(dá)科技有限公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）;恒溫震蕩水浴（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┠[瘤細(xì)胞培養(yǎng)
　　（二）實(shí)驗(yàn)分組
　　1、對照組:PBS+U87細(xì)胞
　　2、紫杉醇組:紫杉醇(4.5μmo

7、l/l)+U87細(xì)胞
　　3、紫草素組:紫草素(2.5μmol/l)+U87細(xì)胞
　　4、1/2紫杉醇+1/2紫草素組:紫杉醇(2.25μmol/l)+紫草素(1.25μmol/l)+U87細(xì)胞
　?。ㄈ〤CK-8法檢測細(xì)胞增殖活性
　　（四）劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力
　?。ㄎ澹㏕ranswell遷移實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力
　?。㏕ranswell侵襲實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞侵襲能力
　?。ㄆ撸〢nne

8、xinⅤ-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡
　?。ò耍┘?xì)胞周期
　　（九）WesternBlot方法檢測p-ERK/ERK的變化
　?。ㄊ┙y(tǒng)計學(xué)處理
　　所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析（Dunnett-t檢驗(yàn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、紫杉醇與紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用抑制U87細(xì)胞增殖<

9、br>　　采用CCK-8法檢測不同濃度的紫杉醇對U87細(xì)胞活力的影響。紫杉醇的給藥濃度分別為0μmol/L，0.1μmol/L，0.5μmol/L，2.5μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L。紫杉醇以濃度依賴性作用方式顯著抑制U87細(xì)胞活力。紫杉醇作用時間為24小時的U87細(xì)胞半數(shù)抑制率為8.97±0.23μmol/L。進(jìn)一步應(yīng)用9μmol/L紫杉醇觀察了不同時間的細(xì)胞活力的變化，紫杉醇作用12h、24h、48h均顯著降

10、低了U87細(xì)胞活力。
　　紫草素以濃度依賴性作用方式顯著抑制U87絀胞活力，與0μmol/L相比，濃度為4μmol/L、8μmol/L的紫草素均顯著抑制細(xì)胞活力。作用時間為24小時的U87細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為5.02±0.44μmol/L。進(jìn)一步應(yīng)用5μmol/L紫草素觀察了不同時間的U87細(xì)胞活力的變化，紫草素作用12h、24h、48h均顯著降低了細(xì)胞活力。選擇24h作為給藥時間點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　選擇濃度為1/4IC5

11、0、1/2IC50及IC50濃度作為聯(lián)合應(yīng)用時所用濃度，即分別選用濃度為2.25μmol/L、4.5μmol/L、9μmol/L的紫杉醇與濃度分別為1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L的紫草素聯(lián)合應(yīng)用作用于U87細(xì)胞24h。CCK-8結(jié)果顯示:兩種藥物的聯(lián)用具有協(xié)同抑制U87細(xì)胞增殖的作用，其中4.5μmol/L紫杉醇與2.5μmol/L紫草素聯(lián)合應(yīng)用組具有顯著的聯(lián)用價值(CDI=0.72)。
　　二、紫杉醇與

12、紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用抑制U87細(xì)胞遷移
　　因紫杉醇及紫草素對U87遷移能力抑制較強(qiáng)，選用濃度為4.5μmol/L濃度紫杉醇、2.5μmol/L濃度紫草素及2.25μmol/L濃度紫杉醇聯(lián)合1.25μmol/L濃度紫草素作用于U87細(xì)胞行劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法觀察U87細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示，在藥物作用24h后，與對照組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著抑制了U87細(xì)胞的遷移能力。與單獨(dú)

13、應(yīng)用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著抑制了U87細(xì)胞的遷移力。
　　三、紫杉醇與紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用抑制U87細(xì)胞侵襲
　　對照組以及4.5μmol/L紫杉醇、2.5μmol/L的紫草素及2.25μmol/L紫杉醇聯(lián)合1.25μmol/L紫草素作用于U87細(xì)胞24h后，各組穿過含BD基質(zhì)膠的Transwell小室的細(xì)胞個數(shù)分別是100±3.2個，65±2.4個，50±2.3個，27±3.3個。與對照

14、組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著抑制了U87細(xì)胞的侵襲能力。與單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著抑制了U87細(xì)胞的侵襲力。
　　四、紫杉醇與紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡
　　單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇與紫草素，以及1/2紫杉醇+1/2紫草素組于U87細(xì)胞24h后，對照組、紫杉醇組、紫草素組及聯(lián)合應(yīng)用組的凋亡率（含壞死細(xì)胞）分別是3.5±1.22％,28.4±2.8

15、9％，35.7±3.42％及40.6±3.76％;與對照組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著促進(jìn)了U87細(xì)胞的凋亡。與單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著促進(jìn)了U87細(xì)胞的凋亡(P＜0.01）。
　　五、紫杉醇與紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞周期的影響
　　對照組，紫杉醇組、紫草素組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的凋亡率分別是0.18±0.43％，4.59±1.98％，0

16、.54±0.80％，8.57±2.8％。同時各組G1期RNA含量分別是52.53±3.35％，24.35±2.45％，61.35±2.29％，28.73±3.24％;各組的G2期RNA含量分別是38.87±1.59％，63.73±2.62％，26.99±2.34％，57.63±3.54％;1/2紫杉醇+1/2紫草素組顯著增加了U87細(xì)胞的凋亡率，同時紫草素組G1期的RNA含量增多，紫杉醇組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的G2其RNA含量

17、顯著增高。
　　六、紫杉醇與紫草素單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用對p-ERK表達(dá)的影響
　　單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇與紫草素以及1/2紫杉醇+1/2紫草素組于U87細(xì)胞24h后，對照組，紫杉醇組、紫草素組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的p-ERK/ERK的比值分別為0.62±0.07％，0.80±0.07％，0.35±0.08％，0.49±0.04％。與對照組相比，紫杉醇組p-ERK/ERK的比值顯著增高（P＜0.05），紫草素組與1/2紫杉醇+1