MiR-422a在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)和功能.pdf

1、目的:
　　鑒于外周血單核細(xì)胞與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，在本研究小組之前已首次報(bào)道m(xù)iR-133a是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥外周血單核細(xì)胞中潛在的生物學(xué)標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，本研究采用微矩陣基因芯片等一系列生物學(xué)方法進(jìn)一步探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血單核細(xì)胞中micoRNA表達(dá)譜，尋找可能的生物標(biāo)志物及其靶基因，并初步觀察其生物學(xué)功能。
　　材料與方法:
　　1.本研究招募相互匹配的20例白種人絕經(jīng)后女性，依據(jù)骨密度值分為低骨密度和高骨

2、密度組各10例。抽取外周靜脈全血，采用密度梯度離心的方法，初步分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，緊接著借助抗原抗體結(jié)合免疫磁珠法篩選出未接觸表面抗體的外周血單核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞純度，應(yīng)用miRNA array芯片技術(shù)，分析獲得miRNA差異表達(dá)譜，選取差異表達(dá)的miRNAs，進(jìn)一步行逆轉(zhuǎn)錄后實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，得出差異表達(dá)基因miR-422a。同時(shí)，采用大致相同的方法檢測(cè)來(lái)自相同外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本中B淋巴細(xì)胞的miR-4

3、22a在低骨密度組和高骨密度組的表達(dá)水平。
　　2.運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選miR-422a潛在的靶基因，對(duì)篩查出的5個(gè)潛在靶基因CBL、CD226、IGF-1、PAG1、TOB2運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其實(shí)際表達(dá)水平，分析與miR-422a表達(dá)水平的相互關(guān)系。
　　3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成熟miR-422a的模擬物或抑制物到正常人外周血單核細(xì)胞，初步觀察miR-422a在外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨樣細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮的作用。

4、r>　　結(jié)果:
　　1.絕經(jīng)后女性高密度組，腰椎骨密度值為（1.128±0.058）g/cm2，腰椎Z值為（2.24±0.59），髖部骨密度值為（1.057±0.101）g/cm2，髖部Z值為(1.94±0.99)。低密度組腰椎骨密度值為（0.826±0.069）g/cm2，腰椎Z值為（-0.63±0.64），髖部骨密度值為（0.725±0.045）g/cm2，髖部Z值為（-1.04±0.45）。髖部和脊柱骨密度和Z值在高骨密度和

5、低骨密度組之間差異顯著(P＜0.001)。MicroRNA矩陣列分析，對(duì)兩組20例單核細(xì)胞RNA樣本中365個(gè)miRNA的表達(dá)水平測(cè)試發(fā)現(xiàn):miR-133a、miR-382差異表達(dá)明顯，miR-422a、mir-27b、miR-151、miR-152呈統(tǒng)計(jì)學(xué)臨界差異表達(dá)水平，且在20例樣本中均檢測(cè)到表達(dá)，具體為:miR-133a的表達(dá)水平在低骨密度組相比高骨密度組有6.48倍的上調(diào)（4.21±2.15 vs.0.65±0.75，P=0.

6、007）， miR-382的表達(dá)水平在低骨密度組相比高骨密度組有3.65倍的上調(diào)（2.74±2.18對(duì)比0.75±0.63，P=0.027）。此外，還有四個(gè)臨界差異表達(dá)的miRNA分子:miR-422a的（2.91±2.55 vs.1.24±0.79,P=0.065）、miR-27b(2.48±2.05 vs.1.02±0.86,P=0.054)、miR-151(1.44±0.87 vs.0.86±0.42,P=0.076)和miR-1

7、52(1.32±0.49 vs.0.91±0.47,P=0.076)。在本研究小組之前已經(jīng)驗(yàn)證miR-133a和miR-382的基礎(chǔ)上，繼續(xù)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別對(duì)在矩陣列分析中四個(gè)臨界差異表達(dá)的miRNA分子進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示:僅miR-422a的表達(dá)水平在低骨密度組和高骨密度組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.31±0.54 vs.0.85±0.27，P=0.029)。其他三個(gè)miRNA分子的表達(dá)水平在低骨密度組和高骨密度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、差異。具體結(jié)果為:miR-27b(1.26±0.66 vs.0.99±0.43,P=0.29)、miR-151(1.37±1.08 vs.0.98±0.41,P=0.30)和miR-152(1.50±1.11 vs.0.95±0.54，P=0.17)。外周血B淋巴細(xì)胞中miR-422a的表達(dá)水平在低骨密度組和高骨密度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.31)。
　　2.借助生物信息學(xué)工具，篩選出CBL、CD226、IGF1、PAG1和TO

9、B2等5個(gè)潛在靶基因。RT-qPCR檢測(cè)顯示這5個(gè)基因在絕經(jīng)后女性外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)在低骨密度組與高骨密度組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體為:CBL(4.82±5.43 vs.2.62±3.27，P=0.29)、CD226(2.79±5.40 vs.2.29±3.72，P=0.81)、 IGF1(1.22±1.39 vs.4.92±6.78，P=0.11)、PAG1(2.65±3.78 vs.2.88±5.43，P=0.92)和TOB2(

10、1.37±2.44 vs.4.96±7.99，P=0.19)。miR-422a的與這五個(gè)潛在靶基因之間的相關(guān)性分析表明:盡管相關(guān)性檢驗(yàn)沒(méi)有差異，但是這5個(gè)基因和miR-422a的之間均存在負(fù)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　3.在單核細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染引入成熟miR-422a的模擬物或抑制物，依據(jù)干預(yù)因素的不同，分為6組，A組（空白對(duì)照組）、B組（誘導(dǎo)分化組）、C組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物陰性對(duì)照組）、D組（

11、誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物組）、E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對(duì)照組）、F組（誘導(dǎo)分化+miRNA抑制物組）。培養(yǎng)至第8天，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況，發(fā)現(xiàn)各組結(jié)果如下:A組（空白對(duì)照組）未見(jiàn)破骨樣細(xì)胞生成;B組（誘導(dǎo)分化組）有一定數(shù)量的破骨樣細(xì)胞;C組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物陰性對(duì)照組）也可見(jiàn)破骨樣細(xì)胞生成，其數(shù)量與B組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;D組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物組）可見(jiàn)破骨樣細(xì)胞生成，其數(shù)量與C組（誘導(dǎo)

12、分化+ miRNA模擬物陰性對(duì)照組）相比明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對(duì)照組）也可見(jiàn)破骨樣細(xì)胞生成，其數(shù)量與B組（誘導(dǎo)分化組）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;F組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物組）可見(jiàn)破骨樣細(xì)胞生成，其數(shù)量與E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對(duì)照組）相比明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。
　　結(jié)論:
　　1.miR-422a是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥一種潛在的外周血單核細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物，在絕經(jīng)后骨