急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞p38的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的：急性心肌梗死發(fā)生后，因血栓形成、心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、殘余心肌細(xì)胞工作負(fù)荷加重、多種體液因子發(fā)生劇烈變化等因素，致使患者心輸出量急劇下降、心臟擴(kuò)大等病理過(guò)程相繼發(fā)生并造成嚴(yán)重后果。本研究采集急性心肌梗死患者外周靜脈血樣，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)急性心肌梗死患者不同時(shí)間點(diǎn)外周靜脈血單核細(xì)胞中p38蛋白的表達(dá)，初步探討p38蛋白的表達(dá)與心梗后炎癥反應(yīng)的關(guān)系。
　　方法：
　　1.病例采集：采集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院、銀川市第一人民醫(yī)

2、院心內(nèi)科急性心肌梗死患者40例做為實(shí)驗(yàn)組（又稱心梗阻），根據(jù)患者心梗時(shí)間將實(shí)驗(yàn)組分為四個(gè)亞組，分別為心梗后3、6、12及24小時(shí)組；同期采集健康成人20例做為健康對(duì)照組；對(duì)于入組的實(shí)驗(yàn)組或健康對(duì)照組成員，符合病例收集標(biāo)準(zhǔn)（見正文）并取得其同意后，抽取其外周靜脈血9ml-10ml送實(shí)驗(yàn)室處理。
　　2.分子生物學(xué)檢測(cè)：
　　2.1單核細(xì)胞的采集：將所采集的血樣平均分裝于3個(gè)離心管中，等倍生理鹽水稀釋。另外選用3個(gè)離心管，每個(gè)離

3、心管各加入單核細(xì)胞分離液3ml。分別將前述稀釋好的血樣緩緩加入單核細(xì)胞分離液中，以血樣和單核細(xì)胞分離液之間明顯分層為佳。將其放入水平低溫離心機(jī)中，3000rmp/min離心25分鐘后取出，此時(shí)可見離心管中呈現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象。收集最上層的淡黃色血清并置入-80℃?zhèn)溆?，同時(shí)將離心管中淡黃色血清之下的單核細(xì)胞層收集于EP管中。
　　2.2單核細(xì)胞的裂解及總蛋白的提?。簩⑸鲜鏊占暮袉魏思?xì)胞的EP管放入4℃離心機(jī)中，3000rmp/mi

4、n離心5分鐘，取出EP管，目視可見白色單核細(xì)胞沉積于EP管底部，棄上清液之后，用PBS緩沖液吹懸單核細(xì)胞后再次3000rmp/min離心5min，完成后再次棄去上清，PBS緩沖液吹懸、離心，該過(guò)程重復(fù)2-3次后可在2個(gè)EP管中得到較為純凈的單核細(xì)胞，此后為三個(gè)EP管編號(hào)為1、2、3號(hào)。向1號(hào)EP管中加入Trizol試劑裂解單核細(xì)胞后置于-80℃保存；向2、3號(hào)EP管中加入事先配置好的蛋白提取液200ul，放于4℃搖床上輕搖15分鐘后置于

5、4℃離心機(jī)中，14000rmp/min離心15分鐘后收集上清，置于另外兩個(gè)EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩４撕?，每份血樣中單核?xì)胞內(nèi)p38α基因的轉(zhuǎn)錄水平、p38蛋白的翻譯水平可分別由熒光定量PCR和western blot等技術(shù)檢測(cè)，血清中TNF-α的含量可由ELISA測(cè)定。結(jié)合上述數(shù)據(jù)可研究p38蛋白在急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及其同TNF-α表達(dá)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、熒光定量結(jié)果：心梗組中四個(gè)亞組與健康

6、對(duì)照組相比，其p38α基因表達(dá)校對(duì)值的差異存在顯著性（F=54.70，P=0.000＜0.05）；在此基礎(chǔ)上，以健康對(duì)照組患者 p38α基因表達(dá)量為1，在急性心肌梗死發(fā)生后的3、6、12、24小時(shí)后，患者外周血單核細(xì)胞中p38α基因的表達(dá)量分別是健康人的1.196倍、1.429倍、1.673倍和1.165倍；
　　2、Western blot印跡結(jié)果：心梗組中四個(gè)亞組p38總蛋白與健康對(duì)照組p38總蛋白相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=

7、1.763，P=0.149＞0.05）；病例組中各個(gè)亞組磷酸化p38蛋白與健康對(duì)照組磷酸化p38蛋白校對(duì)值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1857.56，P=0.000＜0.05）；病例組內(nèi)各個(gè)亞組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）；提示發(fā)生急性心肌梗死后，患者單核細(xì)胞中p38總蛋白未見明顯變化，而磷酸化p38蛋白發(fā)生較為明顯變化，其隨心梗時(shí)間延長(zhǎng)而蛋白表達(dá)量逐步增高，并于急性心肌梗死12小時(shí)后達(dá)到高峰，隨后磷酸化p38蛋

8、白含量逐步下降；
　　3、ELISA測(cè)定血清中TNF-α濃度：心梗組中四個(gè)亞組和健康對(duì)照組患者血清中TNF-α的濃度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=360.25，P=0.000＜0.05）；四個(gè)亞組之間比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）；提示急性心肌梗死發(fā)生后（24小時(shí)之內(nèi)），患者血清中TNF-α的濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增高。
　　結(jié)論：1.急性心肌梗死后12小時(shí)之內(nèi)，患者血液中單核細(xì)胞內(nèi)p38α基因持續(xù)激活，表達(dá)

9、量持續(xù)增加，其功能可能并非是增加 p38蛋白的翻譯水平，而是執(zhí)行某種潛在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　2.急性心肌梗死后12小時(shí)之內(nèi)，患者血液中單核細(xì)胞內(nèi)總p38蛋白表達(dá)量未見明顯變化，而磷酸化蛋白表達(dá)量持續(xù)增加，其功能可能在于啟動(dòng)其下游的相關(guān)信號(hào)分子，并在心梗后心臟功能的惡化過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。
　　3.急性心肌梗死后24小時(shí)之內(nèi)，如果不做任何處理，患者血清中TNF-α的濃度將持續(xù)升高，這種變化可能是磷酸化p38蛋白及眾多細(xì)胞對(duì)