肝郁證模型大鼠海馬內(nèi)差異表達(dá)片段的初步生物信息學(xué)研究.pdf

1、證候以中醫(yī)藏象理論為基礎(chǔ)，又指導(dǎo)著中醫(yī)臨床診治的實(shí)施，是中醫(yī)理論的特色之一，因而成為近年來(lái)中醫(yī)研究的熱點(diǎn)。肝郁證是中醫(yī)肝病的主要證候，是臨床常見(jiàn)的證候之一，具有重要的研究意義。作為一類(lèi)復(fù)雜證候，肝郁證表現(xiàn)不僅涉及肝本身病變，也關(guān)系到全身其它多臟腑系統(tǒng)的復(fù)雜病變。它可產(chǎn)生高級(jí)神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)等多系統(tǒng)多方面改變。 隨著目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)的研究

2、工作已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)中最為重要的研究方向。因此，利用這些技術(shù)研究證候理論是當(dāng)前一熱點(diǎn)的方法。然而目前對(duì)肝郁證的研究大多數(shù)停留在部分已知基因表達(dá)產(chǎn)物(受體、酶、細(xì)胞因子以及肽類(lèi)等)改變的層面上，并沒(méi)有針對(duì)肝郁證這一復(fù)雜證候做系統(tǒng)、整體的分析與整合，遠(yuǎn)未揭示肝郁證的實(shí)質(zhì)。而證候的復(fù)雜表現(xiàn)應(yīng)有其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理，可能不是某一個(gè)或某幾個(gè)基因獨(dú)立發(fā)揮作用的結(jié)果，而是由于基因組整體水平上的調(diào)控發(fā)生紊亂所致。 基于上述認(rèn)識(shí)，本文主要從以下方面進(jìn)

3、行了研究：理論研究隨著后基因組時(shí)代的來(lái)臨，生命科學(xué)的研究重點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)開(kāi)始轉(zhuǎn)向功能基因組水平，這種更重視基因功能、更強(qiáng)調(diào)相互作用關(guān)系和整合的理念，與中醫(yī)的學(xué)術(shù)思想不謀而合。本文分別從整體觀、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程、功能性、個(gè)體化的角度對(duì)中醫(yī)的證候理論與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)之間的相似性做出了論述，力圖通過(guò)以上論述，充實(shí)證候?qū)W研究的手段和方法，使學(xué)者能從全新的角度和層面重新認(rèn)定和評(píng)價(jià)中醫(yī)證候理論。 實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)一肝郁證大鼠

4、動(dòng)物模型的復(fù)制。 在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究再次利用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激方法重復(fù)了肝郁證動(dòng)物模型，并進(jìn)行了1％蔗糖水?dāng)z取量的行為學(xué)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了2次，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均使用SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(空白組)、應(yīng)激模型組(模型組)、應(yīng)激模型+阿米替林組(阿米替林組)，應(yīng)激模型+逍遙散組(逍遙散組)，采用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激方法造模。造模第1天與第22天均測(cè)定了各組大鼠1小時(shí)1％蔗糖水?dāng)z取量。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)初期，各組大鼠1％蔗

5、糖水?dāng)z取量經(jīng)統(tǒng)計(jì)組間無(wú)差異，實(shí)驗(yàn)第22天，模型組1％蔗糖水?dāng)z取量明顯低于對(duì)照組；逍遙散組和阿米替林組攝取量則高于模型組，與對(duì)照組差異不顯著。肝郁證動(dòng)物模型在行為學(xué)方面重復(fù)得到驗(yàn)證。 實(shí)驗(yàn)二生物信息學(xué)分析本部分對(duì)前期分離出的差異顯示片段(1號(hào)與12號(hào))，進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。首先通過(guò)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行ESTs聚類(lèi)，利用軟件對(duì)ESTs進(jìn)行拼接，完成序列的拼接之后，對(duì)重新組裝的contig進(jìn)行功能注釋?zhuān)⑨屵^(guò)程主要結(jié)合了以

6、下幾種方法：對(duì)新生序列進(jìn)行Blastx檢索，如果匹配理想，則利用NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因功能注釋?zhuān)蝗绻谝徊襟E中沒(méi)有理想的匹配，進(jìn)行Blastn檢索，匹配理想則完成注釋?zhuān)蝗绻诙襟E中結(jié)果仍不理想，則利用用Interproscan進(jìn)行蛋白質(zhì)功能域注釋?zhuān)辉谝陨先酵瓿珊螅梢赃M(jìn)行一些后續(xù)的分析。例如用KEGG的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作出初步的整合；如果完成第一至第三步驟后，沒(méi)有理想的結(jié)果，可以初步認(rèn)為是新的基因序列。分析結(jié)果顯示，1號(hào)片段與

7、12號(hào)片段分別代表了GSK3b與St3gal5這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；再進(jìn)一步對(duì)GSK3b與St3gal5的功能加以研究分析后，提示這兩個(gè)基因有可能與肝郁證的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，機(jī)理有待進(jìn)一步研究。 實(shí)驗(yàn)三差異表達(dá)片段的反轉(zhuǎn)錄巢式PCR檢測(cè)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄巢式PCR對(duì)前期實(shí)驗(yàn)分離出的差異顯示片段進(jìn)行了驗(yàn)證，以發(fā)現(xiàn)與肝郁證密切相關(guān)的基因表達(dá)片段，并驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)二部分的生物信息學(xué)分析，從而對(duì)肝郁證實(shí)質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行研究。造模方法同實(shí)驗(yàn)一，動(dòng)物造模末次處

8、理后，快速斷頭處死，冰上取腦，分離海馬，液氮凍存?zhèn)溆?。用Trizol試劑一步法提取模型大鼠海馬總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并針對(duì)前期實(shí)驗(yàn)分離出的差異顯示片段設(shè)計(jì)引物，利用此引物與內(nèi)參(β-actin)引物進(jìn)行雙管PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，將PCR終產(chǎn)物測(cè)序以驗(yàn)證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，之后使用凝膠分析軟件對(duì)電泳圖片作灰度掃描，以目的片段/內(nèi)參作為相對(duì)表達(dá)量，分析比較四組相對(duì)表達(dá)量的高低。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)1號(hào)片段進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期D

9、DRT-PCR的結(jié)果基本吻合，可以認(rèn)為1號(hào)片段模型組表達(dá)量高于空白組，至于阿米替林組表達(dá)量與空白組的關(guān)系，尚不能認(rèn)為阿米替林組高于空白組。 綜上，逍遙散對(duì)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體各方面功能變化具有調(diào)節(jié)作用，以方測(cè)證，我們可以初步認(rèn)為.慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激狀態(tài)時(shí)機(jī)體功能的變化與中醫(yī)學(xué)的肝郁證更加接近。海馬是逍遙散調(diào)節(jié)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激的重要作用部位，眾多基因參與了逍遙散對(duì)慢性應(yīng)激的調(diào)節(jié)，有關(guān)其具體功能和機(jī)理還需要深入研究。