重癥肌無力差異LncRNAs的表達及生物信息學研究.pdf

1、目的:
　　通過lncRNA芯片分析重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤患者組和重癥肌無力胸腺無異常組及健康對照組的差異lncRNAs和mRNA表達;運用生物信息學方法，預測并分析差異lncRNA的共表達靶基因、lncRNA的生物學功能聚類以及參與的信號通路，通過cis和trans預測分析差異lncRNA參與基因調控中作用機制，構建TF-lncRNA-靶基因三者的網(wǎng)絡關系;采用real-time PCR技術，驗證代表性具有差異表達的lncRNAs

2、;為探討lncRNAs在重癥肌無力患者發(fā)病機制中的作用奠定基礎。
　　方法:
　　1.收集重癥肌無力患者及健康正常對照組患者外周血標本，分離外周血淋巴細胞并提取總RNA。
　　2.通過lncRNA芯片，檢測和分析重癥肌無力患者外周血的lncRNA與mRNA表達譜，以差異倍數(shù)大于或等于2，且p小于等于0.05為標準，篩選出重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤患者組與健康對照組比較存在的差異表達lncRNA和mRNA分子。
　　3.

3、通過生物信息學分析，預測靶基因、分析基因聚類、預測富集生物學通路以及構建TF-lncRNA-靶基因網(wǎng)絡關系:利用pearson相關系數(shù)預測差異表達的lncRNA的靶基因;針對差異性表達的lncRNA的靶基因，應用ENCODE數(shù)據(jù)庫預測可能富集的生物學信號通路，進行基因聚類（GO與pathway）分析，關聯(lián)分析構建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡;采用Cytoscape構建TF-lncRNA-靶基因三元網(wǎng)絡關系
　　4.實時熒光PC

4、R驗證具有代表性差異表達lncRNAs:選取lncRNA芯片檢測具有代表性顯著差異表達的lncRNAs，采用real-time PCR技術，驗證其在重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤組和無胸腺異常組及健康對照組中的差異表達。
　　結果:
　　1.lncRNA芯片分析顯示，重癥肌無力胸腺瘤患者組和健康對照比較存在1489個顯著差異lncRNA分子，其中218個上調，1271個下調;有862個差異的mRNA分子，其中上調的mRNA有249個，

5、下調的mRNA有613個。重癥肌無力胸腺無異常患者組和健康對照比較存在342個顯著差異lncRNA分子，其中172個上調，170個下調;存在353個差異的mRNA分子，其中上調的mRNA有263個，下調的mRNA有90個。重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤組和重癥肌無力胸腺無異常組比較存在281個差異顯著lncRNA分子，其中52個上調，229個下調。存在204個差異的mRNA分子，其中上調的mRNA有59個，下調的mRNA有145個。
　　2

6、.在重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤與健康對照組，首先選取差異顯著性上調lncRNA oebiotech_11933、 lncRNA A_24_ P927716和下調顯著性lncRNAA_21_P0010030、lncRNA A_21_P0002844逐一分析其共表達靶基因、GO和pathway，并采用real-time PCR驗證其表達，整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析結果顯示，細胞對干擾素γ的響應在重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤發(fā)病機制

7、中發(fā)揮重要的作用，其次依次為正向調節(jié)細胞因子產生、調節(jié)平滑肌細胞增殖、細胞因子受體結合等生物學功能。通過cis確定了17個lncRNA在染色體上的調控關系;同時通過trans作用機制分析，構建了CTCF、TAF1等轉錄因子與差異lncRNA的二元組關系及其網(wǎng)絡，與mRNA的共表達關系構建 CTCF—lncRNAoebiotech_24272—SOST等三元互相調控網(wǎng)絡。
　　3.在重癥肌無力胸腺無異常組與健康對照組中，選取差異顯著

8、性上調lncRNA oebiotech_11933、lncRNA oebiotech_03926和下調顯著性lncRNA oebiotech_02627、lncRNA oebiotech_22482逐一分析其共表達靶基因、GO和pathway，采用real-time PCR驗證其表達，整體差異lncRNA的GO功和pathway分析結果顯示，血小板脫?；图毎麑Ω蓴_素的響應在其中發(fā)揮重要的生物學功能，其次依次為調節(jié)細胞因子轉導、負向調節(jié)

9、離子運輸、炎癥反應、糖皮質激素刺激、調節(jié)細胞因子生成過程等生物學功能，通過cis確定了6個lncRNA在染色體上的調控關系;通過trans作用機制分析，構建了CTCF、MYC等轉錄因子與差異lncRNA的二元組關系及其網(wǎng)絡，與mRNA的共表達關系構建CTCF—lncRNAA_21_P0007083—NUS1等三元互相調控網(wǎng)絡。
　　4.在重癥癥肌無力胸腺瘤組與重癥肌無力胸腺無異常組，選取差異顯著性上調lncRNA oebiotec

10、h_13222、lncRNA A_19_P00315959和下調顯著性lncRNA oebiotech_22652、lncRNA oebiotech_16223逐一分析其共表達靶基因，GO和pathway，采用real-time PCR驗證其表達。整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析顯示，確定趨化因子受體結合，細胞因子與細胞因子受體相互作用信號通路在其中發(fā)揮重要的生物學功能，其次分別是正向調節(jié)白細胞的遷移運動，細胞因子轉導

11、、離子的運輸?shù)壬飳W功能。通過cis確定了6個lncRNA在染色體上的調控關系;通過trans作用機制分析，構建了CTCF—lncRNA oebiotech_22642—SMCR7L等三元互相調控網(wǎng)絡。
　　5.整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析結果顯示，與健康對照組比較，無論MG是否合并胸腺瘤，細胞對干擾素γ的響應均在發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用;而MG合并胸腺瘤組與胸腺無異常組比較，趨化因子受體結合，細胞因子與細胞

12、因子受體相互作用信號通路在其中發(fā)揮重要的生物學功能，其次分別是正向調節(jié)白細胞的遷移運動，細胞因子轉導、離子的運輸?shù)壬飳W功能。
　　結論:
　　1.通過lncRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)了重癥肌無力并發(fā)胸腺瘤患者組和重癥肌無力胸腺無異常組及健康對照組的差異表達的lncRNAs和mRNAs。
　　2.通過分析三組部分差異lncRNA的cis和TF調控關系，確定了lncRNA在染色體上的調控關系。
　　3.通過trans作用機