白藜蘆醇抑制人結(jié)腸癌細胞增殖和誘導凋亡及與COX-2關系的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是嚴重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一,多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，早期患者接受根治性手術聯(lián)合輔助治療，但約半數(shù)病人術后仍死于轉(zhuǎn)移和(或)復發(fā)。以5FU、伊立替康、奧沙利鉑、卡培他濱等為基礎的化療藥物療效達到平臺，化療藥天然不敏感或很快耐受,且毒副作用大引起大家關注。因此，尋求低毒高效的天然植物成分成為近幾年來結(jié)腸癌抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點。
　　白藜蘆醇（resveratrol）是一種重要的植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、花生、桑葚中。

2、各項研究顯示，白藜蘆醇存在抗炎、抗氧化、抗血栓、抗突變等生物活性劑藥理作用。同時人們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還具有顯著的抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)為抗細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、干預細胞信號轉(zhuǎn)錄、增強抑癌基因活性及抑制癌基因表達。
　　環(huán)氧合酶( COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素過程中重要的限速酶,其主要產(chǎn)物是前列腺素PGE2，PGD2等。它包含兩種亞型：COX-1和 COX-2。近年來很多研究圍繞 COX-2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制進行

3、，并取得重大進展。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與人類上皮來源的惡性腫瘤尤其是消化系統(tǒng)惡性腫瘤有密切的聯(lián)系，研究表明COX-2在結(jié)腸腫瘤中表達增高。在肝癌、乳腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有較強的抑制COX-2的藥理作用，且白藜蘆醇能通過抑制COX的環(huán)氧合酶活性和氫過氧化物酶活性而在腫瘤促進階段起抑制作用。
　　目前白藜蘆醇抗腫瘤作用在多種腫瘤包括肝癌、乳腺癌、胃癌等體外細胞實驗及動物模型上得到證實，但目前白藜蘆醇的抗腫瘤作用機制尚不十分明確。

4、因此，有必要研究白藜蘆醇對結(jié)腸癌的抗腫瘤活性及其相關機制。本研究以人結(jié)腸癌SW480細胞株為實驗對象，研究白藜蘆醇對結(jié)腸癌細胞增殖及凋亡的影響及機制，并探討其抗腫瘤作用與COX-2的關系，以期為其在結(jié)腸癌治療方面提供新的基礎理論依據(jù)。
　　第一部分白藜蘆醇對人腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制探討
　　目的：體外觀察白藜蘆醇對 SW480腸癌細胞株增殖及細胞周期的影響，并探討白藜蘆醇促進腸癌凋亡的可能相關分子機制。

5、　　方法：將SW480人腸癌細胞株于37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng)。1、待細胞呈對數(shù)生長，接種于96孔培養(yǎng)板，設實驗組、空白組、陰性對照組，經(jīng)不同濃度白藜蘆醇（0，10，20，30，50ug/ml）作用不同時間（24h，48h，72h）后應用MTT法檢測白藜蘆醇對細胞增殖的影響，并計算IC50；2、將細胞接種于6孔板，設置空白對照組、不同濃度給藥組，應用流式細胞術檢測細胞凋亡周期。3、以RT-PCR法檢測不同濃度白藜蘆醇作用48h后，

6、細胞凋亡相關基因bcl-2、bcaspase-9和caspase-3 mRNA表達水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1、MTT比色結(jié)果顯示：白藜蘆醇能明顯抑制SW480人腸癌細胞增殖，隨著藥物濃度（0-50ug/ml）遞增及作用時間的延長（24h、48h及72h），其抑制率明顯延長，范圍為17.4-57.1%，呈顯著濃度-時間依賴性。低濃度時(≤10ug/ml)，腫瘤抑制作用不顯著。相同濃度白藜蘆醇作用48h及72h抑制率均比2

7、4h高，具有統(tǒng)計學意義。相同濃度白藜蘆醇作用72h抑制率比48h高，無統(tǒng)計學意義。白藜蘆醇作用于SW480人腸癌細胞24h、48h及72h的IC50值分別為91.19±0.017ug/ml，32.58±0.022ug/ml及29.49±0.024ug/ml。
　　2、流式細胞術分析結(jié)果提示：（1）隨著白藜蘆醇濃度（0，20，30，50ug/ml）逐漸增大，早期凋亡比例從3.8至15.7%，晚期凋亡所占比例為0.9-32.2%，凋亡

8、細胞總比例從4.7增加至47.9%，呈明顯濃度依耐性。（2）不同濃度白藜蘆醇作用SW480人腸癌細胞株， S期細胞比例增加， G1期的細胞比例減少，提示白藜蘆醇能誘導SW480細胞 S期阻滯。
　　3、RT-PCR檢測結(jié)果顯示：隨著白藜蘆醇濃度（0，20，30，50ug/ml）逐漸增大， bcl-2/GAPDH光密度積分值的比值呈降低的趨勢；caspase-9/GAPDH及caspase-3/GAPDH各濃度組光密度積分值的比值呈

9、增高的趨勢。
　　結(jié)論：
　?。?）一定濃度的白藜蘆醇作用于對人腸癌SW480細胞具有增殖抑制和促進凋亡的作用，且成時間-濃度依耐性。
　　（2）白藜蘆醇誘導 SW480細胞 S期阻滯,進而誘導細胞凋亡。
　　（3）白藜蘆醇作用于腸癌SW480細胞，通過下調(diào)Bcl-2基因表達，上調(diào)caspase-9及caspase-3基因表達，從而引發(fā)細胞色素C-Apaf-1-caspase-9-caspase-3凋亡通路的激活

10、可能是其誘導細胞凋亡的機制之一。
　　第二部分白藜蘆醇抗腫瘤作用與COX-2的關系
　　目的：探討白藜蘆醇對 SW480腸癌細胞株的抗腫瘤作用與COX-2之間的關系。
　　方法：
　　1、設計三條COX-2 siRNA引物轉(zhuǎn)染SW480人腸癌細胞，采用RT-PCR篩選出最佳的靶向COX-2 siRNA進行后續(xù)轉(zhuǎn)染，利用MTT法檢測COX-2表達被抑制后細胞增殖的情況。
　　2、Western-Blottin

11、g實驗：將CCD-18Co正常人結(jié)腸細胞及SW480、HT29人腸癌細胞株細胞株于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。呈對數(shù)生長后接種到96孔板，利用Western-Blotting檢測正常人腸細胞及腸癌細胞COX-2蛋白表達的區(qū)別。同一條件下培養(yǎng)SW480人腸癌細胞24h，分別加入不同濃度白藜蘆醇（10、20、30及50ug/ml）作用48h，設空白組對照組。利用Western-Blotting檢測不同濃度白藜蘆醇對腸癌細胞COX-2及

12、PGE2蛋白表達的影響。靶向COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞后72h，加入30ug/ml濃度白藜蘆醇作用48h。設陰性對照組、藥物作用組、單純轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染后藥物作用組。利用Western-Blotting檢測白藜蘆醇作用于轉(zhuǎn)染后SW480細胞的COX-2蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)光密度掃描分析顯示：COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染72 h后,1號、2號及3號COX-2siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對照及陰性對照組相比

13、，COX-2/GAPDH光密度積分值的比值均顯著降低,提示COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染后，COX-2 mRNA表達受到抑制。其中2號COX-2 siRNA抑制COX-2 mRNA表達作用更強，故以2號序列作為COX-2 RNAi設計作為后續(xù)轉(zhuǎn)錄實驗。
　　2、MTT實驗結(jié)果提示：與空白對照組及陰性siRNA轉(zhuǎn)染對照組相比，2號COX-2siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞后48h后細胞增殖開始受到抑制,72h細胞增殖抑制明顯。提示COX-2

14、siRNA轉(zhuǎn)染后，SW480細胞增殖受到抑制。
　　3、Western-Blotting實驗結(jié)果提示：（1）正常人結(jié)腸細胞CCD-18Co及人結(jié)腸癌細胞SW480、HT29中均表達COX-2蛋白。正常人結(jié)腸細胞CCD-18Co的COX-2/β-actin光密度積分值比值低于人結(jié)腸癌細胞SW480、HT29，差異具有統(tǒng)計學意義。提示COX-2蛋白在結(jié)腸癌中的表達高于正常人結(jié)腸細胞。（2）隨著白藜蘆醇濃度遞增(0-50ug/ml)，C

15、OX-2及PGE2與β-actin光密度積分值的比值均逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義。提示隨著白藜蘆醇作用濃度的提高，SW480細胞COX-2表達及PGE2表達下降，且呈濃度依賴性的。（3） COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染組與β-actin光密度積分值的比值較陰性對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義。提示COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染后可降低COX-2蛋白的表達。白藜蘆醇30ug/ml作用于COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染組后，其COX-2與β-actin光