白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制肝細(xì)胞脂肪變性的作用及機(jī)制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）目前已成為全球主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，我國(guó)成年人患病率約占20％，且有逐步發(fā)展成肝硬化甚至肝癌的趨勢(shì)，然而，至今尚未發(fā)現(xiàn)有效防治NAFLD的理想藥物。白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)是一種天然多酚類(lèi)植物化合物，已有報(bào)道稱(chēng)其具有緩解NAFLD的生物學(xué)作用。但是其潛在的作用機(jī)制尚不清楚。自噬最近被認(rèn)為在防止NAFLD發(fā)展過(guò)程中有關(guān)鍵的

2、保護(hù)作用。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，自噬可將細(xì)胞內(nèi)部分或全部脂滴包裹在由自噬雙層膜結(jié)構(gòu)形成的囊泡內(nèi)，并運(yùn)送至溶酶體，使之降解為脂肪酸。自噬的增加能促進(jìn)脂肪酸的β氧化，進(jìn)而減少肝臟脂質(zhì)的積累;同時(shí)，當(dāng)自噬相關(guān)基因7(ATG7)敲除后自噬被沉默，進(jìn)一步加劇了NAFLD的進(jìn)展。有研究表明，RSV可通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞自噬，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。RSV能否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而抑制肝臟脂肪變性及RSV在細(xì)胞內(nèi)的確切作用靶點(diǎn)和機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

3、　　本課題使用PA處理HepG2細(xì)胞建立肝細(xì)胞脂肪變性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并用高脂肪飲食誘導(dǎo)小鼠建立NAFLD模型。首先，應(yīng)用油紅O染色法、HE染色法、甘油三酯(triglyceride，TG)含量檢測(cè)觀察RSV對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響;然后，應(yīng)用激光共聚焦、透射電鏡等技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞自噬，并結(jié)合使用自噬激動(dòng)劑、自噬抑制劑、RNAi和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，研究誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬在RSV改善肝脂肪變性中的作用。最后，應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)了RSV對(duì)體內(nèi)外肝細(xì)胞上調(diào)沉默信息調(diào)

4、節(jié)因子1(Silent information regulator1，SIRT1)，蛋白激酶A(Protein kinase A，PRKA)和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated Adenosine5'-monophosphate activated protein kinase, pAMPK)的表達(dá)的影響，并應(yīng)用腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cyclase，AC)抑制劑KH7，PRKA抑制劑H-89，AMPK抑制劑

5、Compoud C或SIRT1抑制劑EX-527，或者使用PRKA，AMPK，SIRT1的siRNA處理細(xì)胞，深入研究cAMP/PRKA/AMPK/SIRT1信號(hào)通路在RSV誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬改善肝細(xì)胞脂肪變性中的作用。
　　主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)RSV能明顯改善肝細(xì)胞脂肪變性，主要表現(xiàn)為能減少肝細(xì)胞中TG的含量。
　　(2)自噬在RSV改善肝細(xì)胞脂肪變性中有關(guān)鍵作用。當(dāng)延長(zhǎng)RSV處理時(shí)間，及增加RSV的處理劑量

6、，肝細(xì)胞的自噬表達(dá)水平都上升，而當(dāng)抑制自噬，RSV抑制肝細(xì)胞脂肪變性的作用減弱。
　　(3)RSV調(diào)控肝細(xì)胞自噬過(guò)程中，SIRT1信號(hào)通路扮演著重要角色。RSV能顯著增加肝細(xì)胞cAMP的含量，促進(jìn)PRKA的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)MPK的表達(dá)，并促進(jìn)SIRT1的表達(dá);而當(dāng)使用RNAi沉默干擾PRKA、AC、AMPK、SIRT1的表達(dá)或抑制PRKA、AC、AMPK、SIRT1的活性后，經(jīng)RSV處理，肝細(xì)胞的自噬表達(dá)水平明顯下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在