白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬和凋亡性死亡的機(jī)制研究.pdf

1、【背景及目的】：
　　背景：白藜蘆醇(resveratrol，RSV)即3,4’,5-三羥基-1,2-二苯乙烯(3,4',5-trihydroxystilbene;C14H12O3)在自然界中分布廣泛，是一種具有很強(qiáng)的生物性的天然的多酚類(lèi)化合物，尤其在葡萄、紅酒、藍(lán)莓、桑葚、花生、虎杖等植物和食品中的含量非常豐富。目前白藜蘆醇在心血管和癌癥方面的功能已經(jīng)得到大量實(shí)驗(yàn)證明，顯示了其在抗氧化，抗癌，抑制炎癥等生物學(xué)上的作用。研究表明白

2、藜蘆醇可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但其對(duì)于不同的腫瘤細(xì)胞，其抗腫瘤機(jī)制是不一樣的；白藜蘆醇能誘導(dǎo)不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡或者是自噬性死亡，但二者之間的相互關(guān)系以及機(jī)制尚不明確。已有文獻(xiàn)表明，白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60死亡能通過(guò)凋亡途徑，但自噬是否在此過(guò)程中存在，并是何種功能，尚未得到研究和重視。本實(shí)驗(yàn)以人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞作為研究對(duì)象，重點(diǎn)對(duì)白藜蘆醇抑制該細(xì)胞增殖的凋亡和自噬機(jī)制之間的相關(guān)性進(jìn)行了深入的研究。
　　目的：

3、1.研究白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制；
　　2.研究白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬的機(jī)制；
　　3.研究凋亡和自噬現(xiàn)象在白藜蘆醇誘導(dǎo)HL60細(xì)胞死亡中的相互關(guān)系。
　　【材料和方法】：
　　用含10％超級(jí)新生牛血清的 RPIM-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞，用相對(duì)應(yīng)的抑制劑或激活劑(Compound C,3-MA，Rapamycin，Bafilomycin A1，Z-DEVD-FMK

4、等)或者干擾RNA（SiAtg5，SiBeclin-1，SiP62，SiLC3)預(yù)處理細(xì)胞，并用含不同濃度的白藜蘆醇(0μM,25μM，50μM,100μM)的培養(yǎng)基處理處于對(duì)數(shù)期的HL-60細(xì)胞0-48小時(shí)后，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；DAPI染色分析細(xì)胞凋亡；caspase-3試劑盒檢測(cè)caspase-3酶活性的變化；流式細(xì)胞Annexin v-FITC PI雙染法技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞所占比例；全波長(zhǎng)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定相關(guān)的熒光值變化(線

5、粒體膜電位)；免疫熒光觀察凋亡和自噬相關(guān)基因在細(xì)胞中的亞定位和表達(dá)；Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量；RNA干擾技術(shù)分析信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　【結(jié)果】：
　　1. MTT法檢測(cè)，白藜蘆醇抑制人急性早幼粒HL-60細(xì)胞增殖，且這種作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系，經(jīng)過(guò)計(jì)算白藜蘆醇作用24 h后 IC50為58μM。
　　2. DAPI染色及流式細(xì)胞術(shù)Annexin v-FITC/PI雙染法以及Western Blot

6、技術(shù)檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)24 h、0~100μM白藜蘆醇及0-48 h、50μM白藜蘆醇作用HL-60細(xì)胞時(shí)，有明顯凋亡現(xiàn)象出現(xiàn),且該現(xiàn)象與白藜蘆醇的劑量和作用時(shí)間呈依賴(lài)性關(guān)系。caspase-3酶活性的檢測(cè)結(jié)果是隨著白藜蘆醇作用時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的增加顯示caspase-3酶活性增強(qiáng)；并且加入caspase-3抑制劑后，caspase-3酶活性，細(xì)胞生存率及蛋白表達(dá)量均有所下降。
　　3.全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)羅丹明123染色后的經(jīng)過(guò)白藜蘆醇

7、處理的細(xì)胞顯示其線粒體膜電位逐漸下降；Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)線粒體通路的相關(guān)蛋白表達(dá)顯示隨著白藜蘆醇作用濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax/Bcl-2比值上升，Bad磷酸化水平降低。說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡經(jīng)過(guò)線粒體通路。
　　4. Westen Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡死亡受體通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)Fas-L，F(xiàn)as逐漸增加，caspase8被激活，Bid逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閠Bid。說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡

8、也經(jīng)過(guò)死亡受體通路。
　　5.免疫熒光，Western Blot技術(shù)檢測(cè)以及PCR技術(shù)分析等實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)0-100μM白藜蘆醇作用HL-60細(xì)胞0-48 hours時(shí)，有明顯自噬現(xiàn)象出現(xiàn),且該現(xiàn)象與RSV的劑量和作用時(shí)間呈依賴(lài)性關(guān)系。Western Blotting以及PCR技術(shù)分析顯示自噬相關(guān)基因Beclin-1及P62的表達(dá)量增加。 siRNA干擾相關(guān)的基因的表達(dá)后，自噬現(xiàn)象減弱。
　　6. MTT細(xì)胞存活率檢測(cè)法，cas

9、pase-3酶活性檢測(cè)及自噬抑制劑，激活劑，siRNAs分析等試驗(yàn)分析顯示白藜蘆醇誘導(dǎo)的自噬引起細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡。
　　7. Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)通路的蛋白表達(dá)，隨著白藜蘆醇作用濃度增加和作用時(shí)間增長(zhǎng)，AMPK-mTOR通路被激活，激活P-AMPK，P-Raptor,下游的P-p70s6K表達(dá)量降低，這種升高或降低能明顯的被相關(guān)的抑制劑逆轉(zhuǎn)，同時(shí)自噬現(xiàn)象被相關(guān)抑制劑減弱。說(shuō)明AMPK通路參與白藜蘆醇誘導(dǎo)的

10、HL-60細(xì)胞自噬。
　　8. MTT細(xì)胞存活率檢測(cè)法，caspase-3酶活性檢測(cè)及自噬抑制劑，激活劑，Caspase-3抑制劑，siRNAs分析等試驗(yàn)分析顯示白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡和自噬同時(shí)存在且存在一定程度的正相關(guān)。
　　【結(jié)論】：
　　1.白藜蘆醇在一定濃度、時(shí)間范圍內(nèi)抑制體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，其機(jī)制與白藜蘆醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡和自噬性死亡有關(guān)。