狂犬病毒糖蛋白膜外區(qū)調(diào)控樹突狀細(xì)胞激活的研究.pdf

1、狂犬病(rabies)是由狂犬病毒（Rabies virus，RABV）引起的損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病后死亡率幾近100％。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有不少于59000人死于狂犬病，我國是狂犬病高發(fā)的國家之一。
　　RABV為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長約12kb，其基因組共編碼五個結(jié)構(gòu)蛋白，按病毒RNA3'→5'方向分別是N、 P、M、G和L蛋白，其中G蛋白是唯一暴露在狂犬病毒表面的囊膜蛋白，是病毒進(jìn)入機(jī)體后引起先天

2、性免疫應(yīng)答的最主要抗原。據(jù)報道，狂犬病毒激活DC是與其G蛋白特異相關(guān)的。狂犬病毒固定毒株能引起高水平的DC激活，從而激起機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的中和抗體;而街毒株狂犬病毒不能激活DC，不誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而逃逸機(jī)體先天性免疫應(yīng)答。
　　本實驗室之前的研究表明，狂犬病毒街毒株G蛋白結(jié)合和進(jìn)入DC的效率較低，不易引起DC激活，從而使病毒逃逸先天性免疫應(yīng)答。因此，街毒株的免疫逃逸是由病毒的G蛋白決定的。但是G蛋白上調(diào)控這種逃逸機(jī)制

3、的結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵位點并不清楚。另外，大量研究表明狂犬病毒街毒株G蛋白的表達(dá)量比固定毒株G蛋白的表達(dá)量顯著降低。然而狂犬病毒街毒株G蛋白介導(dǎo)的免疫逃逸是否與G蛋白的表達(dá)量有關(guān)尚未得到驗證。
　　本研究以固定毒株B2c和街毒株SHBRV-18為研究對象，在B2c反向遺傳操作平臺的基礎(chǔ)上，將B2c G蛋白的各功能結(jié)構(gòu)域（包括信號肽、膜外區(qū)、跨膜域和膜內(nèi)區(qū)）分別替換為SHBRV的對應(yīng)序列，拯救出嵌合各功能域的重組病毒。通過測定各病毒的生長動

4、力學(xué)曲線和病毒感染細(xì)胞后的熒光斑大小，發(fā)現(xiàn)B2c G蛋白的信號肽、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)突變?yōu)镾HBRV對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的重組病毒感染細(xì)胞后在細(xì)胞間的擴(kuò)增能力及最高滴度沒有顯著改變;而B2c G蛋白全長序列或者G蛋白膜外區(qū)突變?yōu)镾HBRV對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的重組病毒感染細(xì)胞后在細(xì)胞間的擴(kuò)增能力及最高滴度均顯著降低。因此，狂犬病毒感染細(xì)胞和在細(xì)胞上增殖能力是由G蛋白的膜外區(qū)決定。
　　為了研究G蛋白表達(dá)水平調(diào)控區(qū)域，將各個重組的狂犬病毒感染細(xì)胞后，對重組

5、病毒在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞膜上的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。western blot結(jié)果表明，將B2c G蛋白的膜內(nèi)區(qū)突變?yōu)镾HBRV的對應(yīng)序列后，獲得的重組病毒(rB2c/SHB-Gct)在細(xì)胞內(nèi)G蛋白表達(dá)水平顯著降低。同時，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦的結(jié)果也表明該重組病毒在細(xì)胞膜表面的量與SHBRV相似，均顯著低于B2c。因此，狂犬病毒G蛋白的表達(dá)水平是由G蛋白自身的膜內(nèi)區(qū)來調(diào)控的。
　　同時利用流式細(xì)胞術(shù)對各重組病毒激活DC的水平進(jìn)行統(tǒng)計分

6、析，發(fā)現(xiàn)B2c G蛋白膜外區(qū)替換為SHBRV對應(yīng)區(qū)域之后，得到的重組病毒(rB2c/SHB-Get)喪失了激活DC的能力。G蛋白表達(dá)量顯著降低的重組病毒rB2c/SHB-Gct激活DC的水平有一定程度的下調(diào)，但與rB2c相比，無顯著差異。為進(jìn)一步研究膜外區(qū)調(diào)控DC激活的機(jī)制，對重組病毒吸附和進(jìn)入DC的能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)B2c G蛋白的膜外區(qū)突變之后，病毒吸附和進(jìn)入DC的能力顯著降低。因此，狂犬病毒G蛋白膜外區(qū)決定了病毒感染DC的能力，