應(yīng)用小RNA下調(diào)GRP78表達與上調(diào)KLF4表達抑制前列腺癌細胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　研究一 非對稱雙鏈小干擾RNA下調(diào)細胞內(nèi)GRP78表達的抑制前列腺癌細胞惡性生物學(xué)行為的研究
　　背景：
　　前列腺癌是泌尿外科常見的腫瘤，隨著醫(yī)學(xué)界對這一疾病的認識不斷深入，針對前列腺癌的治療手段亦趨于多樣化，但是對于去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）仍缺乏有效治療手段。近年來，針對CRPC的基因治療逐漸成為研究熱點，而其中尋找到能夠發(fā)揮抗前列腺癌效應(yīng)基因靶點顯得尤為重要。葡萄糖調(diào)節(jié)

2、蛋白78KD（GRP78）是一種在腫瘤細胞生存和進展過程中發(fā)揮重要作用的蛋白，近年的研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)多種類型腫瘤細胞中的GRP78表達可發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。然而，目前尚缺少通過下調(diào)GRP78觀察其能否在前列腺癌中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的研究。此外，近期的部分研究表明非對稱小干擾RNA（asiRNA）可比傳統(tǒng)的對稱性小干擾RNA更加有效且持久的下調(diào)靶基因的表達。因此在本研究中，針對GRP78的mRNA序列設(shè)計了一系列的非對稱小干擾RNA，以觀察其對前列腺

3、癌細胞生物學(xué)行為的效應(yīng)。
　　方法：
　　通過RT-PCR和Western Blotting方法評估了三種不同的前列腺細胞系中GRP78的表達水平；針對GRP78的mRNA序列設(shè)計并合成了一系列非對稱小干擾RNA；通過流式細胞術(shù)篩選合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染濃度；對去勢抵抗性前列腺癌PC-3細胞進行轉(zhuǎn)染后，觀察非對稱小干擾RNA下調(diào)細胞內(nèi)GRP78表達的效應(yīng)，并與對稱性小干擾RNA進行比較；隨后觀察特異性下調(diào)GRP78對PC-3細

4、胞生長率，凋亡及遷移的影響；通過檢測caspase信號途徑相關(guān)蛋白和細胞遷移相關(guān)蛋白探討非對稱小干擾RNA下調(diào)細胞內(nèi)GRP78抗前列腺癌效應(yīng)的可能機制。
　　結(jié)果：
　　相對于傳統(tǒng)的對稱性小干擾RNA，針對GRP78mRNA設(shè)計的15bp非對稱小干擾RNA（asiGRP78-3）表現(xiàn)出了更強的下調(diào)PC-3細胞GRP78表達水平的效應(yīng)。通過asiGRP78-3下調(diào)GRP78在PC-3中的表達，可抑制PC-3細胞生長率，誘導(dǎo)其凋

5、亡并抑制其遷移能力。進一步研究表明，GRP78下調(diào)抑制了PC-3細胞的AKT磷酸化并下調(diào)pro-caspase9和pro-caspase3表達，可能是asiGRP78-3促進PC-3細胞凋亡的機制；下調(diào)GRP78的同時PC-3細胞中波形蛋白（vimentin）的表達也下調(diào)，這可能是asiGRP78-3抑制PC-3遷移的機制。
　　結(jié)論：
　　相比于對稱性小分子干擾RNA，非對稱小干擾RNA可更有效的下調(diào)前列腺癌細胞內(nèi)GRP7

6、8表達水平。非對稱小干擾RNA下調(diào)GRP78表達后可抑制前列腺癌細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡并抑制其遷移，因此GRP78具有作為去勢抵抗性前列腺癌的基因治療靶點的價值，而非對稱小干擾RNA在下調(diào)前列腺癌GRP78表達方面具有一定的應(yīng)用價值。
　　研究二 pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達載體表達短發(fā)卡RNA上調(diào)細胞內(nèi)KLF4表達抑制前列腺癌細胞惡性生物學(xué)行為的研究
　　背景：
　　前列腺癌已成為

7、泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。雖然目前針對前列腺癌的治療手段非常多樣，但去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）仍然是前列腺癌的治療難點，因此針對CRPC的基因治療逐漸成為治療熱點。Krüppel樣因子4(KLF4)是細胞內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其表達下調(diào)可促進腫瘤增殖和遷移。近年的研究顯示，小RNA不僅可以下調(diào)細胞內(nèi)特定基因表達，也可以特異性上調(diào)某些基因表達。與人工合成的雙鏈小RNA相比，通過質(zhì)粒載體表達的短發(fā)卡小RNA（shRNA）作用持續(xù)性更

8、佳且可以與靶向分子等材料偶聯(lián)。本研究擬針對KLF4啟動子中特定序列設(shè)計重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達載體，并將其導(dǎo)入前列腺癌細胞PC-3中，觀察其上調(diào)KLF4表達的效應(yīng)，并檢測其對前列腺癌細胞腫瘤生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　本研究根據(jù)shRNA設(shè)計原則，針對KLF4啟動子-496序列設(shè)計并人工合成saKLF4-496激活序列，使用T4 DNA ligase連接酶將合成后的sa

9、KLF4-496連接入重組載體pENTR/CMV-EGFP-U6構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達載體；重組質(zhì)粒經(jīng)擴增、提取后測序鑒定；使用陽離子聚合物將pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496轉(zhuǎn)染入PC-3細胞，優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率后，以RT-PCR方法和Western Blotting方法檢測PC-3細胞內(nèi)KLF4表達情況；采用transwell方法，檢測轉(zhuǎn)染了pENTR/CMV-E

10、GFP-U6-saKLF4-496的PC-3細胞遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建的針對KLF4啟動子-496序列設(shè)計的重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達載體；轉(zhuǎn)染此載體后96小時，RT-PCR檢測到PC-3細胞內(nèi)KLF4 mRNA表達上調(diào)，轉(zhuǎn)染后96小時Western Blotting檢測到PC-3細胞內(nèi)KLF4蛋白表達上調(diào)；Transwell檢測表明，轉(zhuǎn)染pENTR/CMV-