前列腺癌多藥耐藥細胞中PDLIM4基因表達上調機制分析.pdf

1、隨著我國老齡化趨勢的加快，以及生活環(huán)境、飲食習慣等改變，前列腺癌(prostatecancer，PCa)作為老年男性惡性腫瘤，其發(fā)病率日趨增長，且中晚期患者的比例遠遠大于國外，已成為嚴重威脅男性健康的社會問題。PCa作為激素依賴性腫瘤，其細胞增殖主要受雄激素/雄激素受體(Androgenreceptor，AR)信號途徑調節(jié)，因此內分泌治療是治療中晚期PCa的首選方法。但絕大多數(shù)對內分泌治療敏感的PCa患者在治療后1年左右復發(fā)，發(fā)展成為激

2、素難治性前列腺癌(Hormonerefractoryprostatecancer，HRPC)，大約超過半數(shù)以上的HRPC患者會有骨骼和軟組織轉移，死亡率高。由于HRPC的病理機制復雜、且不完全清楚，臨床缺乏有效的治療策略，化療仍是目前主要的治療手段之一。與米托司酮等僅緩解患者臨床癥狀的藥物相比，以多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)為基礎的化療方案，是已被證實可適當延長HRPC患者生存期的藥物，然而約50％的轉移性HRPC患者對多西

3、紫杉醇不敏感，或藥物治療后產(chǎn)生較強的毒性反應，病情惡性發(fā)展。因此，深入細致的理解HRPC演變的“內在性機制”以及對Doc產(chǎn)生耐藥性的“獲得性機制”，一直是研究者極為關注的課題。本課題組前期已通過Doc誘導激素非依賴前列腺癌細胞PC3細胞、構建多藥耐藥細胞PC3/Doc，基因表達差異譜芯片結果顯示，除了經(jīng)典的耐藥基因、抗凋亡基因表達上調外，一些轉錄因子、癌基因、抑癌基因等也存在不同程度的變化。由于癌基因、抑癌基因的異常表達也是形成多藥耐藥

4、的機制之一，本論文初步探討芯片中表達顯著上調的抑癌基因PDLIM4的調控機制。
　　 PDLIM4基因，又稱RIL(reversion-inducedLIMgene)，是定位于5號染色體長臂上31.1的基因，編碼含PDZ和LIM區(qū)域的蛋白，目前報道該基因屬于抑癌基因，其功能研究尚不多。在前列腺癌中，PDLIM4基因啟動子區(qū)域甲基化，導致該基因表達沉默，其中的具體機制并不清楚。DNA甲基化屬于表觀遺傳學的范疇，是基因組DNA的一種

5、主要表觀遺傳修飾形式，是調節(jié)生物功能的重要手段，DNA甲基化修飾并不改變基因序列。DNA甲基化過程主要是通過三種DNA甲基化轉移酶DNMT1，DNMT3A，DNMT3B完成的。通常發(fā)生在基因轉錄調控區(qū)域（例如基因啟動子區(qū)域）的DNA甲基化可導致基因轉錄失活，抑癌基因的表達沉默易導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于DNA甲基化是一個動態(tài)可逆的過程，通過DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Az

6、a)逆轉調控區(qū)域的甲基化可使沉默的基因恢復表達。
　　 我們對激素依賴性前列腺癌細胞株PC3及其構建的多西紫杉醇耐藥細胞株PC3/Doc進行了表達譜芯片分析，其中PDLIM4在耐藥細胞株中呈現(xiàn)高表達。我們首次報道了PDLIM4基因在前列腺癌耐藥細胞株中高表達，并對PDLIM4基因在前列腺癌耐藥細胞株中高表達機制進行了分析，并對PDLIM4基因與前列腺癌耐藥的關系進行了初步探討，分析PDLIM4是否可以成為耐藥前列腺癌治療的新靶點

7、。
　　 目的:
　　 探討PDLIM4基因在前列腺癌中表達，以及PDLIM4基因在耐藥細胞株PC3/Doc、K562/A02中的作用。
　　 方法:
　　 1.PDLIM4在前列腺癌及其它細胞利用定量PCR、Westernblot、免疫熒光等方法檢測PDLIM4在前列腺癌細胞株及其他細胞株（K562等）中的表達情況;
　　 2.利用Westernblot和DNA甲基化酶活檢測等方法比較PC3和P

8、C3/Doc在DNMTs方面的差異;
　　 3.利用甲基化特異性PCR(MSP)技術檢測PDLIM4啟動子區(qū)域甲基化情況;
　　 4.利用RNA干擾技術分析PDLIM4基因在耐藥細胞株PC3/Doc中的作用。
　　 5.利用細胞轉染檢測DNA甲基化結合蛋白MBD2對PDLIM4表達的影響。
　　 結果:
　　 一.PDLIM4在耐藥細胞株中的高表達具有組織特異性
　　 1.檢測前列腺細胞株

9、中PDLIM4的表達
　　 PDLIM4基因在RWPE1細胞株中高表達，在DU145、LNCaP細胞株中低表達或者無表達。在前列腺癌PC3細胞中表達甚低，而在與其對應的多藥耐藥PC3/Doc細胞中高表達（P＜0.05)。PDLIM4隨著PC-3/Doc細胞耐藥倍數(shù)的增加，其mRNA水平、蛋白表達均逐漸升高(P＜0.05)。
　　 2.檢測PDLIM4在其他耐藥細胞株中的表達
　　 PDLIM4在K562及其耐藥細

10、胞株K562/A02中均有表達，但在耐藥細胞K562/A02中的表達低于其敏感細胞。而H460及其耐藥細胞株H460/Doc中均未檢測到PDLIM4的表達。
　　 二.DNMTs影響PDLIM4的表達，但不是唯一因素
　　 1.檢測前列腺細胞株中DNMTs的表達
　　 PDLIM4在正常上皮RWPE1細胞中高表達，而DNMT1、3A、3B表達量相對較低
　　 2.PC3細胞株用5-Aza處理后，在mRNA

11、水平PDLIM4表達上調并不明顯;而5-Aza處理LNCaP細胞株后，PDLIM4上調明顯。
　　 3.PC3與PC3/Doc在DNMTs表達水平上無明顯差別，但在耐藥細胞株PC3/Doc中DNMTs的活性降低。
　　 4.與PC3相比，PC3/Doc中PDLIM4啟動子區(qū)域的甲基化程度降低。
　　 5.PC3/Doc中的甲基化DNA結合蛋白MBD2不表達，通過過表達MBD2并不影響PDLIM4的表達。