骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合靜電紡絲生物活性支架治療椎間盤(pán)退變的研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:下腰痛是一種主要由椎間盤(pán)退行性改變引起的嚴(yán)重影響人類(lèi)生活質(zhì)量的臨床疾病。細(xì)胞治療是生物治療的一種，在治療退行性疾病方面具有良好的前景。成人間充質(zhì)干細(xì)胞是一種很有吸引力的細(xì)胞源，不僅可以直接用于椎間盤(pán)退行性疾病的治療，還可以與組織工程支架結(jié)合，移植入病變區(qū)域進(jìn)行治療。方
　　法:使用健康成人骨髓標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照Majumdar的方法，首先使用梯度密度離心法分離單核細(xì)胞，再

2、通過(guò)貼壁培養(yǎng)得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間，繪制生長(zhǎng)曲線。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型。分別進(jìn)行成骨、成脂、成軟骨方向的誘導(dǎo)，檢測(cè)細(xì)胞的干性。
　　結(jié)果:順利得到了成人間充質(zhì)干細(xì)胞。光鏡下觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。對(duì)其貼壁率、倍增時(shí)間和生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)證明得到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞表面CD29，CD44，CD166表達(dá)陽(yáng)性，而CD34，CD44，HL

3、A-DR表達(dá)為陰性。三系誘導(dǎo)分化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞，具有良好的分化潛能。
　　結(jié)論:我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　第二部分靜電紡絲技術(shù)制備含生長(zhǎng)因子TGF-β1的組織工程椎間盤(pán)支架及表征評(píng)價(jià)
　　目的:椎間盤(pán)退變與髓核鈣化密切相關(guān)。靜電紡絲技術(shù)是一種可以制備具有細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似結(jié)構(gòu)的納米纖維生物活性支架的有效方法。
　　方法:實(shí)驗(yàn)中，

4、我們使用兩種方法制備納米纖維支架。第一種采用單軸混紡的方法，以聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和TGF-β1為原料制備納米纖維支架。第二種方法采用同軸靜電紡絲的方法制備納米纖維支架，其中內(nèi)層原料是TGF-β1和PVA，外層原料是PLGA。支架制備完成后進(jìn)行表征評(píng)價(jià)，通過(guò)掃描電鏡(SEM)，透射電鏡(TEM)，高效液相色譜分析(HPLC)，傅立葉紅外光譜(FTIR)等方法進(jìn)行了檢測(cè)。
　　結(jié)果:通過(guò)摸索條件，成

5、功制備了單軸和同軸靜電紡絲支架。SEM結(jié)果顯示，兩種方法制備的支架具有相似的紡絲直徑以及蛋白釋放特性。單軸方法制備的靜電紡絲支架具有更好的親水性，另外加入蛋白質(zhì)可以增加支架的親水性。傅立葉紅外檢測(cè)證明我們成功制備了含有生長(zhǎng)因子TGF-β1的兩種支架。
　　結(jié)論:單軸和同軸電紡技術(shù)都能在合適的條件下制備含生長(zhǎng)因子TGF-β1的生物活性支架。不同制備方法以及是否含有蛋白質(zhì)都會(huì)影響支架表面的親水性。成功制備兩種生物活性支架為進(jìn)一步的體外

6、實(shí)驗(yàn)提供了條件。
　　第三部分體外實(shí)驗(yàn):含TGF-β1的靜電紡絲支架及低氧條件對(duì)hMSCs向髓核樣細(xì)胞分化的影響
　　目的:間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的增殖和分化潛能，可以作為髓核再生的合適種子細(xì)胞。體內(nèi)環(huán)境的變化可以影響MSCs的分化方向。
　　方法:實(shí)驗(yàn)中，我們分別在制備好的靜電紡絲生物活性支架上接種MSCs細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞在支架上的增殖和粘附特性。之后，在常氧條件和低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并在21天后使用qPCR的方法檢測(cè)細(xì)