Ⅱ型膠原荷載成髓核細胞分化的脂肪間充質干細胞修復椎間盤退變的體內外研究.pdf

1、椎間盤退行性疾病在臨床上極為常見，是導致45歲以下人群勞動能力受限的最主要原因，每年都造成巨大的經濟損失和社會負擔。髓核退變是椎間盤退變過程的開始，并且髓核細胞減少和髓核基質合成與降解失衡是其主要的始動因素。細胞移植是針對椎間盤退變病因的治療方法，其中脂肪間充質干細胞(Adipose-derived Stem cell，ADSC)在既往的研究中用于退變椎間盤的干細胞治療。而隨著預處理方法的提出，間充質干細胞經成髓核細胞誘導分化后獲得的細

2、胞被認為是用于退變髓核修復的細胞來源之一。此外，Ⅱ型膠原作為髓核內細胞外基質的重要組分，是正常髓核組織主要存在的膠原類型，具有良好的生物相容性和降解特性，是用于髓核修復的天然細胞載體材料。在本研究中，通過體外研究TGF-β3和IGF-1生長因子聯(lián)合應用誘導ADSCs成髓核細胞分化，及Ⅱ型膠原對ADSCs增殖、分化等生物學活動的影響，并在體研究Ⅱ型膠原荷載成髓核細胞分化的ADSCs修復豬退變椎間盤，驗證其修復效果。本研究分為以下四個部分:

3、
　　(1)TGF-β3和IGF-1聯(lián)合誘導脂肪間充質干細胞成髓核細胞定向分化;
　　(2)細胞外基質中Ⅱ型膠原含量對脂肪間充質干細胞成髓核細胞分化的影響;
　　(3)轉錄因子FoxA2參與Ⅱ型膠原誘導脂肪間充質干細胞成髓核細胞分化;
　　(4)Ⅱ型膠原荷載成髓核細胞分化的脂肪間充質干細胞修復豬退變椎間盤。
　　第一章 TGF-β3和IGF-1聯(lián)合誘導脂肪間充質干細胞成髓核細胞定向分化
　　目的:研究

4、TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用誘導脂肪間充質干細胞(ADSCs)成髓核細胞定向分化的作用及其機制。
　　方法:ADSCs的增殖和生存率分別通過CCK-8法及流式細胞方法檢測。細胞三維微球培養(yǎng)用于成髓核細胞分化的檢測。分化后細胞SOX9、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖的表達通過實時定量PCR及蛋白免疫印跡檢測。
　　結果:細胞外基質的沉積通過硫酸糖胺聚糖評估。軟骨細胞和髓核細胞的特異性表型基因用于鑒別細胞分化

5、類型。并對分化過程中MAPK/ERK和TGF/Smad信號通路進行了檢測。TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用能增加ADSC的生存率，細胞外基質合成以及成髓核細胞分化的能力。TGF-β3和IGF-1的聯(lián)合作用是通過激活MAPK/ERK信號通路實現的。
　　結論:TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用能促進ADSC的生存及成髓核細胞分化的能力，可能應用于在體研究促進退變椎間盤的修復。
　　第二章 細胞外基質中Ⅱ型膠原含量對脂肪間充質干細

6、胞成髓核細胞分化的影響
　　目的:椎間盤退變過程中，髓核組織的Ⅱ型膠原分解和Ⅰ型膠原合成增強可能會影響移植后干細胞的生物學活性，體外研究細胞外基質中Ⅱ型膠原含量對脂肪間充質干細胞成髓核細胞分化的影響。
　　方法:ADSCs三維微球培養(yǎng)或者培養(yǎng)在梯度變化的Ⅰ/Ⅱ型膠原支架中。細胞的增殖和凋亡分別通過CCK-8法和LDH法檢測。細胞中SOX9、型膠原、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測。軟骨細胞和

7、髓核細胞的特異性表型基因用于鑒別細胞分化類型。
　　結果:阿爾新藍染色和DMMB法用于檢測細胞外基質中硫酸糖胺聚糖的沉積。并對PI3K/AKT，MAPK/ERK和TGF/Smad信號通路進行了檢測。結果表示，膠原支架具有良好的生物安全性。Ⅱ型膠原能夠部分促進ADSCs增殖。SOX9、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達以及硫酸糖胺聚糖的合成與Ⅱ型膠原在支架中的比例成正相關。髓核細胞特異性表型基因角蛋白19僅在單純Ⅱ型膠原處理組中高表達。此

8、外，Ⅱ型膠原對ADSCs誘導分化機制，可能是通過激活ADSCs中MAKP/ERK通路進而上調磷酸化Smad3的表達。
　　結論:Ⅱ型膠原促進ADSCs成髓核細胞分化并增強其細胞外基質合成能力。椎間盤退變過程中，髓核組織的Ⅱ型膠原分解和Ⅰ型膠原合成增強對ADSCs的分化及基質合成能力有負面影響。
　　第三章 轉錄因子FoxA2參與Ⅱ型膠原誘導脂肪間充質干細胞成髓核細胞分化
　　目的:Ⅱ型膠原是正常髓核的主要細胞外基質成分

9、。轉錄因子FoxA亞家族成員在中軸和椎間盤發(fā)育中有重要作用。研究轉錄因子FoxA2可能參與的Ⅱ型膠原誘導脂肪間充質干細胞成髓核細胞分化過程。
　　方法:ADSCs培養(yǎng)在不同濃度Ⅱ型膠原包被的培養(yǎng)器皿上。細胞中SOX9、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測，角蛋白19及FoxA1/A2/A3的表達通過實時定量PCR檢測。并且通過免疫熒光檢測FoxA2的表達及分布。通過慢病毒過表達和敲低ADSC

10、s中FoxA2的表達用于研究Ⅱ型膠原誘導分化的可能機制。
　　結果:細胞中SOX9、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和角蛋白19的表達和Ⅱ型膠原處理濃度及時間（14天內）具有正相關。FoxA2在Ⅱ型膠原處理的ADSCs中高表達。過表達FoxA2增強Ⅱ型膠原的誘導分化作用，反之，敲低FoxA2抑制其作用。并且Ⅱ型膠原通過激活ADSCs中MAPK/ERK信號通路上調FoxA2的表達。
　　結論:Ⅱ型膠原誘導ADSCs成髓核細胞分化的作用與

11、處理劑量和時間呈正相關。FoxA2是參與Ⅱ型膠原誘導分化作用的關鍵轉錄因子。
　　第四章 Ⅱ型膠原荷載成髓核細胞分化的脂肪間充質干細胞修復豬退變椎間盤
　　目的:研究Ⅱ型膠原荷載成髓核細胞分化的脂肪間充質干細胞修復巴馬小型豬退變椎間盤模型的作用。
　　方法:分離、培養(yǎng)和鑒定巴馬小型豬ADSCs。通過針刺法進行巴馬小型豬退變椎間盤造模，并根據腰椎不同節(jié)段分組情況進行處理:對照組(NC) L1-L2，不造模，不處理;退變組

12、(DC) L2-L3，造模后注射DMEM高糖培養(yǎng)基;預分化ADSCs注射組(SC) L3-L4，造模后注射成髓核細胞分化的ADSCs;不含細胞的Ⅱ型膠原注射組(CII) L4-L5，造模后注射Ⅱ型膠原;含預分化ADSCs的Ⅱ型膠原注射組(SC-CII) L5-L6，造模后注射成髓核細胞分化的ADSCs和Ⅱ型膠原。
　　結果:在各時間點，通過MRI評估椎間盤情況。處理后第24周，對椎間盤進行組織學及免疫組織化學檢測，并對髓核進行生物