Ⅱ型膠原荷載成髓核細(xì)胞分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)椎間盤退變的體內(nèi)外研究.pdf

1、椎間盤退行性疾病在臨床上極為常見(jiàn)，是導(dǎo)致45歲以下人群勞動(dòng)能力受限的最主要原因，每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)負(fù)擔(dān)。髓核退變是椎間盤退變過(guò)程的開(kāi)始，并且髓核細(xì)胞減少和髓核基質(zhì)合成與降解失衡是其主要的始動(dòng)因素。細(xì)胞移植是針對(duì)椎間盤退變病因的治療方法，其中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived Stem cell，ADSC)在既往的研究中用于退變椎間盤的干細(xì)胞治療。而隨著預(yù)處理方法的提出，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化后獲得的細(xì)

2、胞被認(rèn)為是用于退變髓核修復(fù)的細(xì)胞來(lái)源之一。此外，Ⅱ型膠原作為髓核內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，是正常髓核組織主要存在的膠原類型，具有良好的生物相容性和降解特性，是用于髓核修復(fù)的天然細(xì)胞載體材料。在本研究中，通過(guò)體外研究TGF-β3和IGF-1生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)ADSCs成髓核細(xì)胞分化，及Ⅱ型膠原對(duì)ADSCs增殖、分化等生物學(xué)活動(dòng)的影響，并在體研究Ⅱ型膠原荷載成髓核細(xì)胞分化的ADSCs修復(fù)豬退變椎間盤，驗(yàn)證其修復(fù)效果。本研究分為以下四個(gè)部分:

3、
　　(1)TGF-β3和IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞定向分化;
　　(2)細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原含量對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞分化的影響;
　　(3)轉(zhuǎn)錄因子FoxA2參與Ⅱ型膠原誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞分化;
　　(4)Ⅱ型膠原荷載成髓核細(xì)胞分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)豬退變椎間盤。
　　第一章 TGF-β3和IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞定向分化
　　目的:研究

4、TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)成髓核細(xì)胞定向分化的作用及其機(jī)制。
　　方法:ADSCs的增殖和生存率分別通過(guò)CCK-8法及流式細(xì)胞方法檢測(cè)。細(xì)胞三維微球培養(yǎng)用于成髓核細(xì)胞分化的檢測(cè)。分化后細(xì)胞SOX9、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白免疫印跡檢測(cè)。
　　結(jié)果:細(xì)胞外基質(zhì)的沉積通過(guò)硫酸糖胺聚糖評(píng)估。軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞的特異性表型基因用于鑒別細(xì)胞分化

5、類型。并對(duì)分化過(guò)程中MAPK/ERK和TGF/Smad信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用能增加ADSC的生存率，細(xì)胞外基質(zhì)合成以及成髓核細(xì)胞分化的能力。TGF-β3和IGF-1的聯(lián)合作用是通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論:TGF-β3和IGF-1聯(lián)合作用能促進(jìn)ADSC的生存及成髓核細(xì)胞分化的能力，可能應(yīng)用于在體研究促進(jìn)退變椎間盤的修復(fù)。
　　第二章 細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原含量對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)

6、胞成髓核細(xì)胞分化的影響
　　目的:椎間盤退變過(guò)程中，髓核組織的Ⅱ型膠原分解和Ⅰ型膠原合成增強(qiáng)可能會(huì)影響移植后干細(xì)胞的生物學(xué)活性，體外研究細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原含量對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞分化的影響。
　　方法:ADSCs三維微球培養(yǎng)或者培養(yǎng)在梯度變化的Ⅰ/Ⅱ型膠原支架中。細(xì)胞的增殖和凋亡分別通過(guò)CCK-8法和LDH法檢測(cè)。細(xì)胞中SOX9、型膠原、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)。軟骨細(xì)胞和

7、髓核細(xì)胞的特異性表型基因用于鑒別細(xì)胞分化類型。
　　結(jié)果:阿爾新藍(lán)染色和DMMB法用于檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸糖胺聚糖的沉積。并對(duì)PI3K/AKT，MAPK/ERK和TGF/Smad信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表示，膠原支架具有良好的生物安全性。Ⅱ型膠原能夠部分促進(jìn)ADSCs增殖。SOX9、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)以及硫酸糖胺聚糖的合成與Ⅱ型膠原在支架中的比例成正相關(guān)。髓核細(xì)胞特異性表型基因角蛋白19僅在單純Ⅱ型膠原處理組中高表達(dá)。此

8、外，Ⅱ型膠原對(duì)ADSCs誘導(dǎo)分化機(jī)制，可能是通過(guò)激活A(yù)DSCs中MAKP/ERK通路進(jìn)而上調(diào)磷酸化Smad3的表達(dá)。
　　結(jié)論:Ⅱ型膠原促進(jìn)ADSCs成髓核細(xì)胞分化并增強(qiáng)其細(xì)胞外基質(zhì)合成能力。椎間盤退變過(guò)程中，髓核組織的Ⅱ型膠原分解和Ⅰ型膠原合成增強(qiáng)對(duì)ADSCs的分化及基質(zhì)合成能力有負(fù)面影響。
　　第三章 轉(zhuǎn)錄因子FoxA2參與Ⅱ型膠原誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞分化
　　目的:Ⅱ型膠原是正常髓核的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分

9、。轉(zhuǎn)錄因子FoxA亞家族成員在中軸和椎間盤發(fā)育中有重要作用。研究轉(zhuǎn)錄因子FoxA2可能參與的Ⅱ型膠原誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞分化過(guò)程。
　　方法:ADSCs培養(yǎng)在不同濃度Ⅱ型膠原包被的培養(yǎng)器皿上。細(xì)胞中SOX9、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)，角蛋白19及FoxA1/A2/A3的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。并且通過(guò)免疫熒光檢測(cè)FoxA2的表達(dá)及分布。通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)和敲低ADSC

10、s中FoxA2的表達(dá)用于研究Ⅱ型膠原誘導(dǎo)分化的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:細(xì)胞中SOX9、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和角蛋白19的表達(dá)和Ⅱ型膠原處理濃度及時(shí)間（14天內(nèi)）具有正相關(guān)。FoxA2在Ⅱ型膠原處理的ADSCs中高表達(dá)。過(guò)表達(dá)FoxA2增強(qiáng)Ⅱ型膠原的誘導(dǎo)分化作用，反之，敲低FoxA2抑制其作用。并且Ⅱ型膠原通過(guò)激活A(yù)DSCs中MAPK/ERK信號(hào)通路上調(diào)FoxA2的表達(dá)。
　　結(jié)論:Ⅱ型膠原誘導(dǎo)ADSCs成髓核細(xì)胞分化的作用與

11、處理劑量和時(shí)間呈正相關(guān)。FoxA2是參與Ⅱ型膠原誘導(dǎo)分化作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。
　　第四章 Ⅱ型膠原荷載成髓核細(xì)胞分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)豬退變椎間盤
　　目的:研究Ⅱ型膠原荷載成髓核細(xì)胞分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)巴馬小型豬退變椎間盤模型的作用。
　　方法:分離、培養(yǎng)和鑒定巴馬小型豬ADSCs。通過(guò)針刺法進(jìn)行巴馬小型豬退變椎間盤造模，并根據(jù)腰椎不同節(jié)段分組情況進(jìn)行處理:對(duì)照組(NC) L1-L2，不造模，不處理;退變組

12、(DC) L2-L3，造模后注射DMEM高糖培養(yǎng)基;預(yù)分化ADSCs注射組(SC) L3-L4，造模后注射成髓核細(xì)胞分化的ADSCs;不含細(xì)胞的Ⅱ型膠原注射組(CII) L4-L5，造模后注射Ⅱ型膠原;含預(yù)分化ADSCs的Ⅱ型膠原注射組(SC-CII) L5-L6，造模后注射成髓核細(xì)胞分化的ADSCs和Ⅱ型膠原。
　　結(jié)果:在各時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)MRI評(píng)估椎間盤情況。處理后第24周，對(duì)椎間盤進(jìn)行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)，并對(duì)髓核進(jìn)行生物