人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人退變椎間盤髓核細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)
　　 目的：探討人退變椎間盤髓核細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)方法。方法：收集15例人退變椎間盤髓核組織，采用0.025％的Ⅱ型膠原酶與0.004％脫氧核糖核酸酶Ⅱ消化分離出髓核細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng)傳代，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法行Ⅱ型膠原染色，甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)髓核細(xì)胞內(nèi)聚集蛋白聚糖的表達(dá)，觀察髓核細(xì)胞的類軟骨表型的表達(dá)。結(jié)果：采用0.025％的Ⅱ型膠原酶加0.004％的脫氧核

2、糖核酸酶Ⅱ4℃過夜消化可較好的分離培養(yǎng)出人退變椎間盤髓核細(xì)胞；原代髓核細(xì)胞平均7天貼壁，細(xì)胞呈類圓形或多角形，細(xì)胞95％融合所需時(shí)間約4周；聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)于分離培養(yǎng)的萌核細(xì)胞，被甲苯胺藍(lán)染成天藍(lán)色，Ⅱ型膠原染色為黃褐色。結(jié)論：采用0.025％的Ⅱ型膠原酶加0.004％的脫氧核糖核酸酶Ⅱ消化法體外成功培養(yǎng)出髓核細(xì)胞；髓核細(xì)胞呈類軟骨表型，合成分泌聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白。
　　 第二部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培

3、養(yǎng)、鑒定及其誘導(dǎo)分化
　　 目的：體外分離培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并檢測(cè)其多向分化潛能。方法：取正常成人骨髓，應(yīng)用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法分離、純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，并利用成骨誘導(dǎo)劑、成脂誘導(dǎo)劑、成軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、成脂、成軟骨方向分化，堿性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油紅O染色、Safranin'O-Fast Gre

4、en染色、阿利新藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其定向分化。結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形外觀；流式細(xì)胞儀分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD29、CD44、CD90表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性。細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天后，堿性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油紅O染色、Safranin'O-Fast Green染色、阿利新藍(lán)染色、Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性。結(jié)論：通過密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法可大量擴(kuò)增、純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間

5、充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能。
　　 第三部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞體外共培養(yǎng)下的相互影響
　　 目的：研究體外人退變髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)共培養(yǎng)時(shí)，NPCs對(duì)BMMSCs的誘導(dǎo)分化效應(yīng)，以及BMMSCs對(duì)NPCs生物活性的影響。方法：取第3代的BMM

6、SCs與第1代NPCs在Transwell板中共培養(yǎng)，建立3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)組，BMMSCs與NPCs共培養(yǎng)組，BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組和NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組。分別于共培養(yǎng)4、8、12天后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)的含量變化以及BMMSCs與NPCs的增殖能力；采用RT-PCR法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)BMMSCs與NPCs的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan

7、及Sox-9基因表達(dá)變化。倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)后BMMSCs及NPCs的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：從第4天起，共培養(yǎng)組上清液中TGF-β1、IGF、PDGF的含量較BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組、NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組顯著增高(P<0.05)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。共培養(yǎng)組中BMMSCs與NPCs細(xì)胞數(shù)量較BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組、NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組明顯增多(P<0.05)。從第4天開始的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共培養(yǎng)組NPCs的聚集蛋白聚糖Aggrecan、S

8、ox-9基因表達(dá)較單獨(dú)培養(yǎng)組高(P<0.05)，并且Ⅱ型膠原在第12天的表達(dá)也顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.05)；同時(shí)從第8天起至第12天，共培養(yǎng)組BMMSCs的Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖Aggrecan、Sox-9基因的表達(dá)較單獨(dú)培養(yǎng)組高(P<0.05)。共培養(yǎng)12d后，BMMSCs及NPCs形態(tài)未見有明顯變化。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在髓核細(xì)胞營(yíng)造的微環(huán)境下向類髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過分

9、泌TGF-β1、IGF、PDGF等細(xì)胞因子發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，激活髓核細(xì)胞，促進(jìn)其增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
　　 第四部分 TGF-β1對(duì)不同程度退變椎間盤的髓核細(xì)胞生物活性的影響
　　 目的：采用外源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)模擬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，探討該營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)對(duì)不同程度退變椎間盤的髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)生物學(xué)活性的影響。方法：?、颉ⅱ?、Ⅳ度退變椎間盤標(biāo)本各2例

10、體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞，建立Ⅱ度退變組、Ⅲ度退變組、Ⅳ度退變組及各自的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組均給予10ng/ml TGF-β1干預(yù)，于第4天檢測(cè)NPCs的增殖能力；采用熒光定量PCR法檢測(cè)NPCs的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表達(dá)變化：Western-blot蛋白印跡分析鑒定蛋白聚糖和p53蛋白在各組NPCs中的表達(dá)；β-半乳糖苷酶染色觀察NPCs衰老情況。結(jié)果：經(jīng)TGF-β1干預(yù)4天后，各退變組NPCs數(shù)量皆有不同程度

11、的增加，但Ⅱ度退變組NPCs數(shù)量較Ⅲ、Ⅳ度退變組增加顯著(P<0.05)。TGF-β1干預(yù)前各退變組NPCsⅠ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表達(dá)未見明顯差異。TGF-β1干預(yù)4天后，各退變組NPCs的基因表達(dá)顯著增加，但Ⅱ度退變組NPCs的Ⅱ型膠原、蛋白聚糖及Sox-9基因表達(dá)較Ⅲ、Ⅳ度退變組NPCs增加顯著(P<0.05)。Western-blot檢測(cè)也顯示Ⅱ度退變組NPCs蛋白聚糖合成顯著優(yōu)于Ⅲ、Ⅳ度退變

12、組(P<0.05)。β-半乳糖苷酶染色顯示Ⅱ、Ⅳ度退變組NPCs衰老發(fā)生率明顯高于Ⅱ度退變組NPCs(P<0.05)。p53蛋白在Ⅲ、Ⅳ度退變組中的表達(dá)也明顯高于Ⅱ度退變組(P<0.05)。Ⅲ度退變組與Ⅳ度退變組之間未見明顯差異。結(jié)論：一定濃度的TGF-β1能夠激活退變髓核細(xì)胞，促進(jìn)其增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。但椎間盤退變程度可通過影響髓核細(xì)胞的生物學(xué)表型，影響TGF-β1干預(yù)的效果。這表明椎間盤退變程度可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入后所分泌