骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)于椎間盤退變?cè)缙谛迯?fù)作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、第一部分 SD大鼠尾椎椎間盤退變模型的建立。 目的：建立大鼠尾椎椎間盤退變模型比較造模后一周、造模后兩周兩組椎間盤病理學(xué)的變化。 方法：選取20只體重(250±20)g的SD大鼠，應(yīng)用針刺注射生物酶的方法建立尾椎的退變模型，分別于建模后一周取其中10只作為I組，兩周后取其中10只大鼠為Ⅱ組。Ⅰ、Ⅱ組尾椎間盤應(yīng)用HE染色和Alcian blue染色通過(guò)病理評(píng)分的方法進(jìn)行比較。 結(jié)果：Ⅰ組可以發(fā)現(xiàn)在HE染色中

2、，原本完整的髓核中產(chǎn)生了空腔，空腔的形態(tài)不規(guī)則，空腔內(nèi)壁相對(duì)連續(xù)。周圍的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整但是產(chǎn)生了褶皺，在Alcian blue染色中，相對(duì)于髓核的位置藍(lán)染比較明顯沒(méi)有明顯的褪色。Ⅱ組HE染色中，髓核出現(xiàn)了不規(guī)則破碎。周圍的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)斷裂屈曲，層狀結(jié)構(gòu)幾乎完全消失。Alcian blue染色中，髓核位置的藍(lán)染出現(xiàn)了較明顯的褪色。病理學(xué)的評(píng)分提示Ⅰ組評(píng)分明顯高于Ⅱ組。 結(jié)論：造模后椎間盤退變程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，造模一周后椎間盤

3、的組織學(xué)形態(tài)更接近于正常的椎間盤，類似于人類椎間盤退變的Ⅰ～Ⅱ級(jí)，造模兩周后椎間盤結(jié)構(gòu)形態(tài)類似于人類椎間盤退變的Ⅲ～Ⅳ級(jí)，從髓核，纖維環(huán)，Alcain blue三組數(shù)據(jù)的病理評(píng)分可以證實(shí)此論點(diǎn)，造模后一周更接近椎間盤早期退變的特點(diǎn)，所以我們也選擇在造模后一周進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。 第二部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化傳代及鑒定。 目的：體外分離純化大鼠BMSCs對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并鑒定細(xì)胞性質(zhì)。　　方法：

4、應(yīng)用貼壁篩選法分離BMSCs，置入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代三次后應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)于其進(jìn)行表面抗原的鑒定。 結(jié)果：細(xì)胞接種后可見(jiàn)到大個(gè)、圓形、折光性強(qiáng)的BMSCs散在分布。24h后細(xì)胞已貼壁。72h后細(xì)胞分裂、增殖成10個(gè)左右細(xì)胞團(tuán)，一周后產(chǎn)生細(xì)胞集落并開(kāi)始融合，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代，傳代后細(xì)胞呈均勻分布生長(zhǎng)，增殖速度加快，生長(zhǎng)均勻，排列規(guī)則，3d左右可以傳代一次。總共傳代三次后，細(xì)胞形態(tài)基本一致，呈長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞邊界清楚，核飽滿居

5、中，細(xì)胞的排列有一定的方向性。細(xì)胞鑒定結(jié)果提示，大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD29,CD44,CD90,CD105顯示陽(yáng)性，而表面抗原CD34,CD45,CD11b為陰性，組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ均為陰性。 結(jié)論：利用貼壁篩選法培養(yǎng)大鼠BMSCs，經(jīng)過(guò)傳代后可以成生純度較高的BMSCs，其生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定，可作為組織工程的種子細(xì)胞。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸鈉混合液修復(fù)早期退變椎間盤的作用目的：建立大鼠尾椎椎間盤退變

6、模型，于其退變?cè)缙冢跓o(wú)外源性生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞支架的作用下，移植BMSCs與透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate，SH)混合液入實(shí)驗(yàn)組椎間盤，比較其在影像學(xué)、病理組織學(xué)及對(duì)應(yīng)成分的RNA表達(dá)上與對(duì)照組的差別。 方法：選取20只大鼠，將其尾椎三個(gè)相鄰的椎間盤由近至遠(yuǎn)分為細(xì)胞植入組、椎間盤退變組、正常對(duì)照組三組。其中細(xì)胞植入組、椎間盤退變組注射生物酶造模，正常對(duì)照組注射對(duì)照試劑。一周后于細(xì)胞植入組組注射BMSCs-SH混

7、合溶液，三周后通過(guò)X-ray，病理切片，RT-PCR比較三組的差別。 結(jié)果：影像學(xué)結(jié)果提示正常對(duì)照組保持了正常的椎間盤高度，細(xì)胞植入組、椎間盤退變組的椎間隙高度明顯降低。病理學(xué)顯示在椎間盤退變組移植細(xì)胞在髓核內(nèi)增殖分化產(chǎn)生了大量的蛋白多糖成分部分維持了椎間盤的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。RT-PCR提示細(xì)胞植入組的Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的mRNA表達(dá)接近于正常對(duì)照組而明顯高于椎間盤退變組。 結(jié)論：在椎間盤高度的維持上細(xì)胞植入組與椎間盤退變組