腦膠質(zhì)瘤組織中惡性程度相關蛋白質(zhì)表達譜的分析與鑒定.pdf

1、研究背景:
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見且最難治的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高死亡率以及低治愈率的特點，預后較差。低度惡性膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級）的平均存活時間是3～5年，而高度惡性膠質(zhì)瘤(WHOⅢ-Ⅳ級)的平均存活時間是1～2年，而總體手術后5年生存率約為6％左右。目前膠質(zhì)瘤的術前定性診斷和復發(fā)檢測的方法主要依賴影像學檢查，臨床診斷和治療方案絕大部分基于組織病理學的診斷，且高度依賴于神經(jīng)病理學家

2、的主觀判斷;此外，膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性和高度浸潤特性經(jīng)常會造成大量的診斷差異，影像學、相關癌基因或腫瘤標記物的檢測對術前估計腫瘤惡性程度都存在假陽性率及假陰性率高的問題，因此膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療方面面臨極大的挑戰(zhàn)。盡管目前的研究表明膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多基因的變化，如抑癌基因的功能喪失、癌基因的活化等，并經(jīng)歷多階段、多步驟的進展過程，但膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的詳盡分子機制并不十分清楚，目前仍缺乏膠質(zhì)瘤特異的分子標記物，因而分析與鑒定膠質(zhì)瘤高特異

3、性、高敏感性的生物標志物迫切且必要。蛋白質(zhì)組學是指對整個基因組表達的所有蛋白質(zhì)的研究，通過分析鑒定細胞、組織或機體所表達的全部蛋白質(zhì)，提供一組蛋白質(zhì)的功能及其表達模式的信息，能夠反映細胞內(nèi)部的遺傳特性和外界因素共同作用的結(jié)果，因此深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機制，鑒定膠質(zhì)瘤特異的生物標記物，客觀上需要在蛋白質(zhì)組的水平進行進一步的探索。由于腫瘤組織能夠直接或間接的產(chǎn)生與腫瘤相關的生物標志物，因此通過研究腫瘤組織成為篩選腫瘤標志物最直接有

4、效的途徑。
　　 研究目的:
　　 篩選與鑒定正常腦組織和惡性程度不同的膠質(zhì)瘤組織蛋白表達差異譜，尋找早期定性診斷和復發(fā)檢測的腫瘤標志物，為膠質(zhì)瘤的分子個體診斷和分子靶向治療奠定了重要理論基礎，增進理解膠質(zhì)瘤多階段發(fā)生發(fā)展的分子機制。
　　 研究方法:
　　 1.研究對象
　　 收集2009-2010年在我院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤手術標本52例，其中WHOⅡ級23例，WHOⅢ級15例，WHOⅣ級14例，所

5、有標本均經(jīng)常規(guī)病理檢查證實。另收集同期住院的需手術切除正常腦組織的12例腦外傷患者的腦組織為對照（正常腦組織組）。
　　 2.組織病理學診斷標準
　　 按照世界衛(wèi)生組織(WHO)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分級標準，Ⅰ級為良性腫瘤，Ⅱ級代表低度惡性，Ⅲ級為惡性腫瘤，Ⅳ級提示高度惡性。所有膠質(zhì)瘤組織都經(jīng)過我院3名神經(jīng)病理學專家確認。
　　 3.蛋白質(zhì)組學方法
　　 3.1組織蛋白的提取及濃度測定
　　 新鮮手術標

6、本切碎，加入適量組織蛋白裂解液后在冰上勻漿，16×1000rpm離心15分鐘，棄去沉淀中不溶組織和細胞殘渣及碎片，上清液即蛋白提取物。蛋白濃度的測定采用BCA法。
　　 3.2蛋白質(zhì)組的二維電泳(2-DE)、圖像分析、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定
　　 雙向電泳的第一項，即等電聚焦采用BioRad的固相pH梯度干膠條(13cm的pH3-10非線性);第二項電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色得到2-DE圖譜。銀

7、染后的蛋白2-DE圖譜經(jīng)ImageScancer(GE)掃描，圖像分析應用ImageMaster。差異蛋白質(zhì)點應用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI)和生物信息學軟件分析，檢索InternationalProteinIndex(IPI)人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，確定蛋白ID。
　　 4.免疫印跡
　　 對GFAP、HSP27、Peroxiredoxin1和CathepsinD蛋白進行免疫印跡的驗證。一維電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將膠上的

8、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性的結(jié)合反應，然后分別與相應一抗孵育、化學發(fā)光法檢測。
　　 5.RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
　　 應用TRIzon（康為）提取手術組織的總RNA，并測定RNA的A260/A280值均在1.6-1.8之間，反轉(zhuǎn)錄后進行pCD和內(nèi)參β-actin特異擴增。
　　 6.免疫組織化學方法（ABC法）檢測pCD在膠質(zhì)瘤中的表達
　　 石蠟切片脫蠟、梯度

9、酒精、抗原修復，3mL/LH2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，1∶50的正常馬血清室溫孵育20min。pCD山羊多抗于濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。生物素標記的抗山羊二抗孵育45min，ABC(1∶1∶50)室溫孵育1h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2顯色。
　　 7.CDsiRNA介導的CD表達降低后體外細胞侵襲實驗檢測
　　 轉(zhuǎn)染48h后的U87細胞胰酶消化，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸U87細胞，調(diào)整U87細胞密度為1×10

10、5/ml，24孔板底部加入0.75ml的10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，插入元件內(nèi)加入含有U87細胞的無血清DMEM培養(yǎng)基0.5ml，37℃培養(yǎng)箱孵育24h后取出轉(zhuǎn)移小室，插入元件進行福爾馬林固定、結(jié)晶紫染色、封片，顯微鏡下觀察計數(shù)，高倍鏡下(40X)隨機選取10個視野，計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)。
　　 8.統(tǒng)計分析
　　 所有標本的二維電泳圖譜經(jīng)ImageMaster2-DElite分析得到標準化體積及差異后，采用SPSS

11、10.0軟件系統(tǒng)中單項的Student'st或ANOVA進行了檢驗分析;對免疫組織化學結(jié)果采用SPSS10.0進行x2檢驗，檢驗的水準為0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.比較分析膠質(zhì)瘤Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級與正常腦組織，共檢測到20個明顯差異表達的蛋白質(zhì)點，其中14個蛋白質(zhì)點表達上調(diào)，6個蛋白質(zhì)點表達降低，差異倍數(shù)均在1.5倍以上，統(tǒng)計學分析表明均有顯著的差異(P＜0.05)。
　　 2.質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學處理

12、及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出15種差異表達的蛋白，其中10種蛋白的表達在Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中升高，包括Heatshockprotein27(HSP27)、Prohibitin、78-kDaglucose-regulatedprotein(GRP78)、Peroxiredoxin1、Peroxiredoxin6、AnnexinⅡ、CathepsinD(CD)、Plasminogenactivatorinhibitor-1、Actin(c

13、ytoplasmic1)、GlutathioneS-transferaseM(GSTM);在Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中表達降低的ProteindisulfideisomeraseA3(PDIA3)、Alpha-crystallinBchain、T-complexprotein1(εsubunit)、Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL1、Glialfibrillaryacidicprotein

14、(GFAP)。
　　 3.免疫印跡結(jié)果表明:GFAP在正常腦組織中表達最高，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增高，GFAP表達逐漸降低，在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達最低;HSP27、Peroxiredoxin1的表達模式與GFAP完全相反，HSP27、Peroxiredoxin1在正常腦組織中表達極低，但在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達明顯升高。在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中，可檢測到CathepsinD(CD)的成熟體和前體(Pro-cathepsinD，pCD)

15、，分子量分別為52kDa和34kDa;與成熟體CD相比，pCD在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中升高尤為顯著。
　　 4.pCDmRNA在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中表達明顯增高。
　　 5.pCD在正常的腦組織中僅見極少量的神經(jīng)細胞膜輕度黃染，正常的膠質(zhì)細胞染色陰性;在Ⅱ級膠質(zhì)瘤細胞的胞漿和胞膜有少量黃染的顆粒，染色級別為+;在Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤細胞的胞漿中散在分布大量的棕黃色顆粒，pCD呈中度至強陽性表達。統(tǒng)計分析表明:與非膠質(zhì)瘤組織相比，Ⅱ級膠質(zhì)

16、瘤中pCD的表達明顯著增高(x2=2.873，P＜0.05);Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤分別與Ⅱ級膠質(zhì)瘤、非瘤組織比較，pCD表達顯著增高(x2=13.965，P＜0.05)。
　　 6.利用CDsiRNA技術沉默人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中CD的表達后，U87細胞增殖明顯減慢，同時U87中的CD沉默后，細胞的轉(zhuǎn)移能力亦顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究應用以2-DE為基礎的蛋白質(zhì)組學技術，共鑒定出15種與膠質(zhì)瘤惡性程