TPX2在腦膠質(zhì)瘤中的表達及其對腦膠質(zhì)瘤進程的影響的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占全部腦腫瘤的45～55％。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學治療和綜合治療等，盡管近年來上述治療措施已取得長足進步，但由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍腦組織無明顯分界且易于復發(fā)，且療效均不甚理想。新的治療手段如基因治療等雖有望成為治愈膠質(zhì)瘤的途徑之一，但是目前仍缺乏理想可靠的治療靶標。因此尋找調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的分子靶標，明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的病理機制，已

2、成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點之一。
　　 本研究擬通過觀察TPX2在不同病理級別腦膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤細胞株中的確切表達情況，并通過研究TPX2在膠質(zhì)瘤細胞株中的異常表達，研究TPX2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能角色。實驗共分為三個部分：第一部分，觀察TPX2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平以及與膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性，調(diào)查TPX2的表達水平與膠質(zhì)瘤患者生存時間的關(guān)系；第二部分，觀察TPX2在U251和U87腦膠質(zhì)瘤細胞株中的mRNA和蛋白

3、表達水平，并調(diào)查TPX2蛋白在U87細胞內(nèi)的亞細胞定位；第三部分，通過RNA干擾的方法抑制TPX2基因在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)表達，觀察其對U87膠質(zhì)瘤細胞株生長、增殖、凋亡等細胞生物學進程的影響理以及TPX2對部分周期和腫瘤相關(guān)性蛋白的影響。
　　 因此，探討TPX2參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及惡變的分子病理機制，有助于明確膠質(zhì)瘤的惡性生物學行為及機理，有望為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的分子靶標。
　　 第一部分人腦膠質(zhì)瘤中TPX2的表

4、達和臨床病理相關(guān)性及生存分析
　　 目的：研究TPX2在腦膠質(zhì)瘤組織中表達水平及其與膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性，TPX2表達水平同膠質(zhì)瘤患者生存時間的關(guān)系。
　　 方法：采用免疫組化染色檢測5例正常腦組織和52例不同級別腦膠質(zhì)瘤中TPX2的表達情況。臨床調(diào)查膠質(zhì)瘤患者，利用生存分析檢驗TPX2表達水平同忠者生存時間的相關(guān)性。然后用實時定量RT-PCR和Western blot雜交分別檢測組織中TPX2蛋白和mRNA在的表達水

5、平。并分析TPX2表達水平同膠質(zhì)瘤級別的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：采用免疫組化法檢測了5例正常腦組織及52例人腦膠質(zhì)瘤石蠟標本中TPX2蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，正常腦膠質(zhì)細胞TPX2蛋白染色為陰性，絕大部分膠質(zhì)瘤標本中可見TPX2蛋白的陽性表達。在大部分其它類型的膠質(zhì)瘤中也可見TPX2蛋白的陽性表達。腦膠質(zhì)瘤的臨床病理級別與TPX2的表達強度與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)；而性別和年齡則無統(tǒng)計學上的差異(P＞0.05)

6、。生存分析表明，TPX2免疫組化染色表達水平同患者生存時間成負相關(guān)(p＜0.05)。根據(jù)TPX2的cDNA序列設計相應引物，應用RT-PCR檢測TPX2 mRNA在52例不同級別腦膠質(zhì)細胞瘤和5例正常腦組織中的表達顯示：TPX2 mRNA表達水平在膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.01)。并且，TPX2 mRNA水平在高級別膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于低級別膠質(zhì)瘤，二者相比差異顯著(P＜0.01)同樣，利用Wes

7、tern blot法測定TPX2蛋白在上述膠質(zhì)瘤組織的表達，結(jié)果顯示：TPX2蛋白在膠質(zhì)細胞瘤組織中表達明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.01)。TPX2在Ⅲ-Ⅳ級(高惡度)膠質(zhì)瘤中高表達，而在Ⅰ-Ⅱ級(低惡度)膠質(zhì)瘤中表達量較低，Ⅲ-Ⅳ級與Ⅰ-Ⅱ級TPX2蛋白的表達量相比較有顯著差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：TPX2在腦膠質(zhì)細胞瘤可見陽性表達。其表達水平同腦膠質(zhì)瘤的級別呈明顯相關(guān)，同膠質(zhì)瘤患者的生存時間呈負相

8、關(guān)。
　　 第二部分TPX2在U87、U252膠質(zhì)母細胞瘤細胞株中的表達
　　 目的：研究TPX2在膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)細胞系U87和U251中的mRNA、蛋白表達水平以及TPX2蛋白在U87細胞內(nèi)的亞細胞定位情況。
　　 方法：應用RT-PCR法檢測TPX2在GBM細胞系U87和U251中的mRNA表達水平，應用細胞Western blot法研究TPX2在U87和U251細胞系中的蛋白表達水平。應用免疫熒光染

9、色，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測TPX2蛋白在U87細胞內(nèi)的表達及亞細胞定位情況。
　　 結(jié)果： RT-PCR結(jié)果提示TPX2 mRNA表達水平在膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251中明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.05)。Western blot法測定TPX2蛋白在U87和U251細胞系中的表達，結(jié)果表明：二者TPX2蛋白水平明顯高于正常腦組織。免疫熒光染色顯示，TPX2蛋白定位于U87細胞核內(nèi)，并且同細胞核內(nèi)紡錘體密切相關(guān)。

10、r>　　 結(jié)論：TPX2位于細胞核內(nèi)，且在GBM細胞中其mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常腦組織。
　　 第三部分TPX2異常表達對U87膠質(zhì)瘤細胞生長、增殖和凋亡的作用以及對部分細胞周期相關(guān)性蛋白的影響
　　 目的：研究通過RNA干擾抑制TPX2基因后對U87膠質(zhì)瘤細胞株生長、增殖、凋亡的作用。
　　 方法：利用RNA干擾抑制U87細胞株內(nèi)TPX2的表達。觀察細胞生長，3H-TdR同位素滲透法測定細胞增殖。流

11、式細胞儀及Hoechst33258染色檢測細胞凋亡測定細胞凋亡。RT-PCR和Western blot測定TPX2異常表達的細胞株AuroraA、Ran、p53、Cyclin D1、Cyclin B1、c-Myc等mRNA和蛋白表達水平變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA可有效導致U87細胞內(nèi)的TPX2表達。抑制了TPX2表達的細胞株同未轉(zhuǎn)染組相比，其生長、增殖明顯降低(p均＜0.01)。經(jīng)流式細胞儀檢測，TPX2 si

12、RNA轉(zhuǎn)染后U87的凋亡率較對照組明顯增加(p＜0.01)。U87細胞內(nèi)TPX2表達抑制后，AuroraA和Ran cyclin B1 mRNA表達均較對照明顯降低，而p53和c-MycmRNA表達均明顯增加，cyclin D1的mRNA表達無顯著變化。同樣，在Western blot實驗中我們發(fā)現(xiàn)上訴蛋白表達同樣有類似結(jié)果。
　　 結(jié)論：TPX2可促進GBM細胞的生長、增殖、侵襲，并導致腫瘤細胞凋亡減少。敲除TPX2表達可促進