諾帝誘導人惡性膠質瘤細胞分化的差異蛋白質組初步研究.pdf

1、惡性膠質瘤對人體危害大,治療困難,研究新型抗膠質瘤藥物及其作用機制具有重要意義.在腫瘤治療學研究中,隨著維甲酸類對早幼粒細胞白血病治療的成功和機制的認識,誘導分化已成為惡性腫瘤治療的新領域和研究熱點.去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA) 是存在于常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中的一種天然成分,是花生四烯酸代謝中脂氧化酶強烈而特異的抑制劑,具

2、有多種生物學功能.近年來的研究先后發(fā)現NDGA對多種實體瘤及體內移植瘤等具有顯著的抑制作用.我們的既往研究結果顯示,NDGA對人惡性膠質瘤細胞系SHG-44在體內和體外均具有顯著的抑制生長及誘導分化作用,并呈明顯的量-效和時-效關系:經NDGA處理的瘤細胞貼壁率和生長速率受抑;細胞異型性變小,胞漿中膠質細絲增多,并伴有線粒體的退變.同時,NDGA處理后細胞周期也有明顯改變,S期和G2/M期比例減少,多休止于Go/G1期;其CDK4、cy

3、clin D1 mRNA和蛋白質表達明顯降低,而P16基因的mRNA和蛋白表達明顯增加;NDGA還可通過下調bcl-2,c-myc基因表達誘導膠質瘤細胞凋亡.我室依據這些結果,以創(chuàng)新路線人工合成出NDGA類化合物諾帝(Nordy),純度可達99﹪以上,并證明它具有抗惡性膠質瘤作用,但機制尚未完全清楚.二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是目前惟一能將數千種蛋白質同時分離與展示的

4、分離技術.為了探討諾帝誘導膠質瘤細胞分化的作用機制,尋找其作用的靶蛋白和(或)效應分子,本文采用2-DE方法比較諾帝處理前后不同惡性程度的三種人膠質瘤細胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG的蛋白質組改變,并采用質譜技術鑒定其中的部分蛋白質,為進一步研究這些蛋白質在誘導分化機制中的作用奠定基礎.主要研究內容和結果如下:1.用不同劑量的諾帝分別處理膠質瘤細胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG 24小時后,膠質瘤細胞出現形態(tài)改變

5、,細胞異型性變小,表現為核漿比例變小,核分裂相減少,細胞突起增多變長;處理72小時后更為明顯,并且200μmol/L諾帝較之100μmol/L的諾帝作用更為明顯.結果證明,諾帝對不同惡性程度的膠質瘤細胞均有誘導分化作用,呈現時-效和量-效依賴性.2.采用200μmol/L諾帝處理72小時后的SHG-44、CHG-5、U-87MG三種細胞系及其相應的空白對照組細胞,分別裂解后提取細胞總蛋白,經Lowry法定量后取每種細胞的處理組及其相應

6、的空白對照組蛋白行二維凝膠電泳.采用固相IPG膠條(pH3-10,13cm)等電聚焦,12.5﹪的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,經0.1﹪考馬斯亮藍染色后獲得清晰的蛋白電泳圖譜.采用PDQuest7.1軟件分別對每種細胞的處理組及其相應的空白對照組圖譜進行數字化量化分析,結果顯示,SHG-44細胞諾帝處理組有698±125個蛋白點(n=3),重復率為81.2﹪; 相應的空白對照組有571±227個蛋白點(n=3),重復率為73.5﹪;具有顯

7、著差異(p<0.05)的蛋白點為23個,其中21個蛋白點表達下調,2個蛋白點表達上調.CHG-5細胞諾帝處理組有712±136個蛋白點(n=3),重復率為83.7﹪;相應的空白對照組有590±211個蛋白點(n=3),重復率為73.6﹪;具有顯著差異(p<0.05)的蛋白點為18個,其中9個蛋白點表達下調,9個蛋白點表達上調.U-87MG細胞諾帝處理組有615±76個蛋白點(n=3),重復率為85.8﹪;相應的空白對照組有630±87個

8、蛋白點(n=3),重復率為81.5﹪;具有顯著差異(p<0.05)的蛋白點為41個,其中38個蛋白點表達下調,3個蛋白點表達上調.上述結果提示,諾帝誘導膠質瘤細胞分化過程中以抑制瘤細胞蛋白表達為主.3.將2-DE結果中部分高表達差異蛋白行MALDI-TOF-MS鑒定,結果顯示以下蛋白質:①一種與actin有同源性的未命名蛋白.②cofilin1.③增殖相關基因A(proliferation-associated gene A).④磷酸

9、甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1).⑤β半乳糖苷酶結合凝集素(beta galactoside binding lectin).⑥交替拼接因子3(alternative splicing factor ASF-3).這些蛋白質在諾帝誘導SHG-44、CHG-5、U87-MG三種不同的膠質瘤細胞分化后均下調表達.此外,SHG-44細胞中Up1也表達下調.但諾帝處理后上調表達的蛋白質在三種細胞中則不盡相同,

10、SHG-44細胞谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S-transferase)表達上調;CHG-5細胞環(huán)孢素A受體(cyclophilin)表達上調;U87-MG細胞則甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )和α烯醇化酶(alpha enolase)表達上調.結合這些下調表達的蛋白質資料分析,推測諾帝誘導分化所導致的膠質瘤細胞生長抑制及凋亡等系增殖相關基因A (pr

11、oliferation-associated gene A)和磷酸甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1)表達下調所致.而諾帝誘導膠質瘤細胞分化所引起的細胞骨架聚合、細胞貼壁率下降則是由一種與actin同源的未命名蛋白及cofilin1表達下調所致.其它如谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S-transferase)、環(huán)孢素A受體(cyclophilin)、甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehy