T細(xì)胞免疫缺陷在結(jié)直腸癌免疫逃逸中的作用機(jī)制初探.pdf

1、結(jié)直腸癌(CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，其分子發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。像其他惡性腫瘤一樣，CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜過程，從最初的腺瘤息肉到晚期的腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，整個(gè)過程可以長達(dá)數(shù)年或數(shù)十年。由于結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)出明顯的階段性特征，因此結(jié)直腸癌一直被視為各種惡性腫瘤中的“模式腫瘤”。結(jié)直腸癌的發(fā)生與細(xì)胞周期、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制有著密切的關(guān)系，近幾年研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)病與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)，但機(jī)制不

2、明。
　　 本研究檢測(cè)了30例正常人、30例結(jié)直腸腺瘤性息肉患者和結(jié)直腸癌不同階段患者各30例的血清中IgG、IgM、IgA的水平和炎性細(xì)胞因子IL-2、4、6、10、12和TGF-β1、VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常人、腺瘤息肉患者和不同階段結(jié)直腸癌患者血清中IgG、IgM、IgA的水平無差異，結(jié)直腸癌患者的IL-12、TGF-β1、IL-6血清濃度與正常人和腺瘤性息肉患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著疾病的惡化，濃度逐漸升高(P<0

3、.05)，IL-6在結(jié)直腸癌C期濃度最高。VEGF的血清濃度在結(jié)直腸癌A期和B期升高，與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其他各組血清濃度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與結(jié)直腸癌不同階段無明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)，IL-2、IL-4和IL-10血清濃度在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由此說明在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中體液免疫無密切相關(guān)性，而與細(xì)胞免疫相關(guān)的免疫抑制因子IL-12、TGF-β1、IL-6可能參與了結(jié)直腸癌免疫逃逸。
　　 通過培養(yǎng)健康人臍

4、血中樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)，以結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為抗原刺激DC細(xì)胞成熟為LyDC，再以LyDC激活T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)正常人、息肉患者和結(jié)腸癌A、B、C、D四期患者的T細(xì)胞體外抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，發(fā)現(xiàn)正常人T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯高于息肉患者和結(jié)腸癌A、B、C、D四期患者的T細(xì)胞體外抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，且息肉患者和結(jié)腸癌A、B、C、D四期患者的T細(xì)胞體外抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性呈線性下降，D期較C期患者T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性低，但沒

5、有明顯區(qū)別，說明息肉患者和結(jié)腸癌A、B、C、D四期患者的T細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞能力下降，反映結(jié)腸癌患者存在T細(xì)胞免疫缺陷。再通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)正常人、息肉患者和結(jié)腸癌A、B、C、D四期患者的外周T細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量在結(jié)直腸癌患者外周血中比健康人外周血中的高，而在淋巴細(xì)胞中所占的比例中結(jié)直腸癌患者與健康人CD4+細(xì)胞和CD8+無顯著差異，均低于腺瘤性息肉患者。這些現(xiàn)象說明，在結(jié)直腸癌患者外周血中CD4

6、+CD25+Treg增多抑制了CD8+細(xì)胞分化，導(dǎo)致結(jié)直腸癌免疫逃逸。
　　 通過種植瘤裸鼠的人源化T細(xì)胞免疫重建，檢測(cè)體內(nèi)結(jié)直腸癌患者和正常人T淋巴細(xì)胞的抗瘤能力，顯示正常人T淋巴細(xì)胞干預(yù)下種植瘤基本沒有明顯生長，結(jié)直腸癌患者T淋巴細(xì)胞干預(yù)下種植瘤生長迅速，說明重建的正常人細(xì)胞免疫已在裸鼠體內(nèi)經(jīng)DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答，而結(jié)直腸癌患者的T細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)經(jīng)DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答非常弱。進(jìn)一步通過FCM均

7、檢測(cè)到生長59天的裸鼠外周血人源性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比率發(fā)現(xiàn)，正常人CD4+T淋巴細(xì)胞所占單個(gè)核細(xì)胞比率為23.78％，CD8+所占單個(gè)核細(xì)胞比率為16.69％，顯示在種植瘤刺激下正常人T淋巴細(xì)胞增多明顯(P<0.05)，特別是CD8+陽性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞增多明顯，而結(jié)直腸癌患者CD4+和CD8+T細(xì)胞卻減少，說明可能種植瘤可能抑制了結(jié)直腸癌患者T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致免疫逃逸。
　　 為了了解分子

8、水平的改變，本研究通過PCR芯片檢測(cè)了正常人、腺瘤性息肉患者和不同階段結(jié)直腸癌患者T淋巴細(xì)胞與免疫有關(guān)的348個(gè)基因改變，以Fold Difference>2和Fold Difference<0.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得了5組有統(tǒng)計(jì)顯著性的差異表達(dá)基因，其中腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌A期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌C期、結(jié)直腸癌D期應(yīng)上調(diào)基因分別為25、62、36、50、77個(gè)，下調(diào)基因數(shù)分別為：35、36、147、142、68個(gè)，分別對(duì)5

9、個(gè)階段的差異基因進(jìn)行GO和Pathway顯著性分析。腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌A期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌C期、結(jié)直腸癌D期上調(diào)基因顯著性GO主要涉及microglial cell activation involved in immuneresponse、positive regulation0f MHC classⅡ biosynthetic process、positive regulation of heterotypi

10、c cell-cell adhesion、eukemia inhibitoryfactor signaling pathway等方面功能。腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌A期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌B期、結(jié)直腸癌C期、結(jié)直腸癌D期差異基因分別參與15、15、17、19、16條顯著性Pathway(P value<0.05且FDR<0.05)。其中細(xì)胞因子及其受體交互作用通路、JAK-STAT信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路在結(jié)直腸癌不同階段T淋巴細(xì)胞中變

11、化最為顯著?；贙EGG中有關(guān)基因間相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的理論計(jì)算并構(gòu)建差異基因間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)Signal-Net。該網(wǎng)絡(luò)從整體上反映了不同階段CRC差異表達(dá)基因之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，并由此推導(dǎo)出CCR7、CCR9、CXCR5、CCL11、CCL4、CCL3等網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。應(yīng)用Serial Test Cluster(STC)的方法，篩選出影響樣本變化的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)模式20種，并以P<0.05為篩選條件，得到5個(gè)顯著性動(dòng)