Irx5a基因在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育表達(dá)譜及與Hoxb4基因相關(guān)性研究.pdf

1、Irx5基因(Iroquois5)于1993年在小鼠體內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)，后在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)高度同源的Irx5基因。對(duì)其的研究發(fā)現(xiàn)，Irx5基因有調(diào)控細(xì)胞分化及促進(jìn)細(xì)胞增殖兩方面作用。Irx5基因在小鼠心室肌、肺泡及視網(wǎng)膜雙極神經(jīng)細(xì)胞的形成中其重要作用;同時(shí)Irx5基因可通過(guò)調(diào)控下游的p53、p21來(lái)促進(jìn)人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞、爪蟾神經(jīng)細(xì)胞增殖。
　　同源盒基因(homeobox gene，HOX)編碼一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅在胚胎發(fā)育中起作用，對(duì)造血

2、干細(xì)胞(HSC)的自我更新和增殖分化也起重要作用。HOX家族中的Hoxb4是造血細(xì)胞分化早期的重要調(diào)控因子，對(duì)調(diào)節(jié)HSC自我更新與分化間的平衡起到重要作用。Hoxb4基因編碼一類(lèi)具有同源盒DNA依賴的結(jié)構(gòu)域核蛋白，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄因子，它能被動(dòng)透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞因子共同作用下對(duì)HSC的擴(kuò)增起促進(jìn)作用。
　　目的:構(gòu)建Irx5a基因部分序列的體外轉(zhuǎn)錄載體Irx5a-pCS2+，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄制備其反義mRNA探針;研究Ir

3、x5a基因在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的表達(dá)情況，并比較與在原始造血組織中過(guò)表達(dá)Hoxb4基因的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)中Irx5a基因表達(dá)的差異，從而為研究Irx5a基因相關(guān)功能以及其與Hoxb4相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:分別收集0.75hpf-72hpf之間多個(gè)時(shí)相的Tubingen野生型斑馬魚(yú)胚胎，從斑馬魚(yú)胚胎提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增Irx5a基因的部分序列，將其克隆入pCS2+質(zhì)粒中，經(jīng)菌落PCR、酶切法及DNA測(cè)序鑒定

4、正確后，利用體外轉(zhuǎn)錄體系制備Irx5a的反義mRNA探針，選取0.75hpf-72hpf之間多個(gè)時(shí)相的Tubingen野生型斑馬魚(yú)胚胎作為空白對(duì)照組，18 hpf-72hpf之間多個(gè)時(shí)相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2: LDEL-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，18hpf-72hpf之間多個(gè)時(shí)相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2:LDEL-Hoxb4-EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎作為實(shí)驗(yàn)組。以Irx5a基因反義mR

5、NA探針經(jīng)斑馬魚(yú)全胚胎原位雜交通過(guò)觀察染色情況研究斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中Irx5a基因的表達(dá)情況及在斑馬魚(yú)體內(nèi)原始造血組織中過(guò)表達(dá)HoxB4基因情況下Irx5a基因的表達(dá)情況有無(wú)改變。
　　結(jié)果:Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、酶切和測(cè)序鑒定正確，電泳結(jié)果顯示以Irx5a的體外轉(zhuǎn)錄載體為模板通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄可得到Irx5a的反義mRNA探針，并通過(guò)原位雜交對(duì)探針的可用性進(jìn)行了確認(rèn)。觀察到3.7hpf空白組斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞、9h

6、pf、12hpf空白組斑馬魚(yú)胚胎后腦神經(jīng)板及腹部中胚層可見(jiàn)黑色的陽(yáng)性雜交信號(hào)，18hpf空白組斑馬魚(yú)胚胎中腦、間腦、后腦、側(cè)板中胚層、咽弓及尾部原腎管可見(jiàn)黑色的陽(yáng)性雜交信號(hào)，24hpf、30hpf、36hpf、48hpf空白組斑馬魚(yú)胚胎中腦、間腦、后腦、咽弓、脊索、耳泡囊及脊髓可見(jiàn)黑色的陽(yáng)性雜交信號(hào)，72hpf空白組斑馬魚(yú)胚胎中腦、間腦、后腦、耳泡囊及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)黑色的陽(yáng)性雜交信號(hào)。胚胎發(fā)育時(shí)期18hpf空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組