Irx5a基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育表達譜及與Hoxb4基因相關性研究.pdf

1、Irx5基因(Iroquois5)于1993年在小鼠體內首先發(fā)現，后在人體內也發(fā)現高度同源的Irx5基因。對其的研究發(fā)現，Irx5基因有調控細胞分化及促進細胞增殖兩方面作用。Irx5基因在小鼠心室肌、肺泡及視網膜雙極神經細胞的形成中其重要作用;同時Irx5基因可通過調控下游的p53、p21來促進人類前列腺癌細胞、爪蟾神經細胞增殖。
　　同源盒基因(homeobox gene，HOX)編碼一類轉錄因子，不僅在胚胎發(fā)育中起作用，對造血

2、干細胞(HSC)的自我更新和增殖分化也起重要作用。HOX家族中的Hoxb4是造血細胞分化早期的重要調控因子，對調節(jié)HSC自我更新與分化間的平衡起到重要作用。Hoxb4基因編碼一類具有同源盒DNA依賴的結構域核蛋白，是一種特異性的轉錄因子，它能被動透過細胞膜進入細胞內，與細胞因子共同作用下對HSC的擴增起促進作用。
　　目的:構建Irx5a基因部分序列的體外轉錄載體Irx5a-pCS2+，通過體外轉錄制備其反義mRNA探針;研究Ir

3、x5a基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育的表達情況，并比較與在原始造血組織中過表達Hoxb4基因的轉基因系斑馬魚中Irx5a基因表達的差異，從而為研究Irx5a基因相關功能以及其與Hoxb4相關性研究奠定基礎。
　　方法:分別收集0.75hpf-72hpf之間多個時相的Tubingen野生型斑馬魚胚胎，從斑馬魚胚胎提取總RNA，應用RT-PCR方法擴增Irx5a基因的部分序列，將其克隆入pCS2+質粒中，經菌落PCR、酶切法及DNA測序鑒定

4、正確后，利用體外轉錄體系制備Irx5a的反義mRNA探針，選取0.75hpf-72hpf之間多個時相的Tubingen野生型斑馬魚胚胎作為空白對照組，18 hpf-72hpf之間多個時相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2: LDEL-EGFP轉基因斑馬魚胚胎作為實驗對照組，18hpf-72hpf之間多個時相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2:LDEL-Hoxb4-EGFP)轉基因斑馬魚胚胎作為實驗組。以Irx5a基因反義mR

5、NA探針經斑馬魚全胚胎原位雜交通過觀察染色情況研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中Irx5a基因的表達情況及在斑馬魚體內原始造血組織中過表達HoxB4基因情況下Irx5a基因的表達情況有無改變。
　　結果:Irx5a-pCS2+重組質粒經菌落PCR、酶切和測序鑒定正確，電泳結果顯示以Irx5a的體外轉錄載體為模板通過體外轉錄可得到Irx5a的反義mRNA探針，并通過原位雜交對探針的可用性進行了確認。觀察到3.7hpf空白組斑馬魚胚胎細胞、9h

6、pf、12hpf空白組斑馬魚胚胎后腦神經板及腹部中胚層可見黑色的陽性雜交信號，18hpf空白組斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、側板中胚層、咽弓及尾部原腎管可見黑色的陽性雜交信號，24hpf、30hpf、36hpf、48hpf空白組斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、咽弓、脊索、耳泡囊及脊髓可見黑色的陽性雜交信號，72hpf空白組斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、耳泡囊及視網膜神經節(jié)細胞層可見黑色的陽性雜交信號。胚胎發(fā)育時期18hpf空白對照組，實驗對照組