Rap1b基因在斑馬魚胚胎內的表達模式及與HoxB4基因在胚胎早期造血發(fā)育過程中的相關性研究.pdf

1、目的：研究Rap1b基因在Tubegin野生型斑馬魚系和HoxB4轉基因斑馬魚系胚胎早期的表達情況以及表達差異，了解在斑馬魚胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育過程中過表達HoxB4基因對Rap1b基因可能產生的影響，進一步研究Rap1b與HoxB4基因在造血系統(tǒng)中可能的相互關系。從而為HoxB4基因引起造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)自我更新能力增強的具體機制提供一定的理論依據。
　　方法：收集0.75hpf-1

2、20hpf多個時相的Tubegin野生型斑馬魚胚胎，用TRIZOL法提取斑馬魚胚胎總 RNA，采用 RT-PCR方法克隆斑馬魚Rap1b基因片段，將得到的Rap1b基因片段和pCS2+質粒經BamHI及EcoRI雙酶切后進行體外連接重組，通過對重組質粒進行雙酶切、菌落PCR以及測序鑒定正確后，經T3 RNA體外轉錄體系合成地高辛標記的Rap1b基因的反義mRNA探針；分別選取三組不同的0.75hpf-72hpf（hours post-f

3、ertilization）之間11個時相點的胚胎，即分別為空白對照組（Tubegin野生型斑馬魚），實驗對照組（轉基因斑馬魚系TG:zLmo2:LDL-EGFP;TG:zLmo2:Cre），實驗組（過表達HoxB4的轉基因斑馬魚系TG:zLmo2:LDL-HoxB4-EGFP;TG:zLmo2:Cre）；用Rap1b反義 mRNA探針進行全胚胎原位雜交，觀察野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中Rap1b基因的表達情況，以及在過表達HoxB4基

4、因的情況下對Rap1b基因表達的影響；在體視鏡下觀察并記錄結果。應用半定量反轉錄-聚合酶鏈反應檢測Rap1b基因mRNA在實驗對照組及實驗組的表達水平。
　　結果：采用RT-PCR方法成功克隆出斑馬魚胚胎Rap1b基因片段；利用基因重組技術構建了pCS2+-Rap1b重組質粒，經酶切、菌落PCR以及測序鑒定證明pCS2+-Rap1b重組質粒構建正確；經T3 RNA體外轉錄體系合成地高辛標記的Rap1b基因的反義mRNA探針；通過全

5、胚胎原位雜交結果顯示：Rap1b基因在 Tubegin野生型斑馬魚胚胎的3.7hpf-72hpf均有表達，表達情況如下：在0.75hpf的細胞分裂連接處、3.7hpf-6hpf的動物極、9hpf的神經外側板、18hpf-24hpf的中后腦邊緣、脊索神經系統(tǒng)、ICM區(qū)及尾芽、30hpf-36hpf的中后腦邊緣、PBI區(qū)、脊索神經系統(tǒng)可見陽性雜交信號、48hpf-72hpf的耳蝸、脊索神經系統(tǒng)可見陽性雜交信號；在造血系統(tǒng)，從36hpf開始表

6、達信號逐漸減弱，直至48hpf消失。Tubingen野生型空白對照組18hpf、24hpf、30hpf、48hpf、72hpf與實驗對照組轉基因系（TG:zLmo2:LDL-EGFP;TG:zLmo2:Cre）18hpf-72hpf之間未見明顯差異；實驗組（TG:zLmo2:LDL-HoxB4-EGFP;TG:zLmo2:Cre）36hpf與空白對照組及實驗對照組比較，在造血系統(tǒng)的PBI區(qū)，實驗組比其他兩組表達增加。半定量反轉錄-聚合酶

7、鏈反應實驗顯示：在36hpf斑馬魚胚胎，實驗組Rap1b基因mRNA的表達水平較實驗對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：完成了pCS2+-Rap1b重組質粒的構建；制備了Rap1b基因的反義mRNA探針。通過對野生型斑馬魚胚胎全時相原位雜交，初步了解了Rap1b基因在Tubingen野生型斑馬魚胚胎早期的時空表達情況，發(fā)現過表達HoxB4基因的斑馬魚36hpf胚胎期造血區(qū)域Rap1b基因表達明顯增強，結合半定量