Hoxb4基因?qū)Π唏R魚胚胎造血發(fā)育的調(diào)控作用以及人成纖維細(xì)胞支持的人胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)全能性研究和核型分析.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 Hoxb4基因?qū)Π唏R魚胚胎造血發(fā)育的調(diào)控作用
　　造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有高度自我更新能力和多向分化潛能的造血前體細(xì)胞，HSC的自我更新是由促進(jìn)生長的正調(diào)控信號和導(dǎo)致凋亡的負(fù)調(diào)控信號之間的平衡來調(diào)控的。同源盒基因B4(Homeobox B4，Hoxb4)是第一個在體內(nèi)、外可以增強(qiáng)HSC自我更新的正調(diào)控信號[1]。早期的研究認(rèn)為，提高

2、Hoxb4的表達(dá)水平，能夠極大地增強(qiáng)HSC的自我更新功能，但基本不影響細(xì)胞的分化、系特異性及終末細(xì)胞的形態(tài)和功能。進(jìn)一步的研究表明，Hoxb4蛋白介導(dǎo)的HSC的擴(kuò)增是濃度依賴的。較高濃度的Hoxb4對造血干細(xì)胞的擴(kuò)增與分化起重要作用。Klump H et.al[2]用不同濃度的Hoxb4蛋白培養(yǎng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hoxb4蛋白處于一定濃度范圍內(nèi)時細(xì)胞能較好地擴(kuò)增而不致分化紊亂，而其濃度小于或大于這一范圍時細(xì)胞出現(xiàn)分化紊亂的現(xiàn)象，目前這一范圍

3、的確定值還未界定。Hoxb4的體外和細(xì)胞水平研究是不能完全闡述其功能和機(jī)制的。模式生物是研究基因功能的一種有效的研究方法，在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用已有悠久的歷史，具有不可替代的作用。斑馬魚是近年新興的模式生物，其應(yīng)用的研究領(lǐng)域很廣，由于其是體外受精，發(fā)育早期胚胎是通體透明的，利用普通的體式顯微鏡就可以清楚地觀察個體發(fā)育，所以其是一個極為有利的研究造血的模式生物。此外，成血成血管干細(xì)胞(hemangioblast)[3]是造血細(xì)胞和血管干/

4、祖細(xì)胞的共同祖細(xì)胞。目前Hoxb4過表達(dá)的動物模型以及其在發(fā)育的成血成血管干細(xì)胞水平過表達(dá)的功能研究尚未報道。
　　目的:
　　本課題擬用新興模式生物斑馬魚建立在發(fā)育的成血成血管干細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)Hoxb4的活體動物模型，進(jìn)一步研究該基因?qū)υ缙谂咛ピ煅恼{(diào)控作用和機(jī)制。
　　方法:
　　我們利用Cre/loxP系統(tǒng)[4]建立以成血成血管干細(xì)胞特異性基因lmo2作為啟動子穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced

5、greenfluorescent protein，EGFP)標(biāo)記的Hoxb4低表達(dá)量的雜合轉(zhuǎn)基因斑馬魚系;并運(yùn)用遺傳學(xué)原理將雜合的Hoxb4轉(zhuǎn)基因系再進(jìn)行內(nèi)交，得到了高表達(dá)Hoxb4的純合系。進(jìn)一步從綠色熒光蛋白表達(dá)觀察，在DNA水平進(jìn)行基因組PCR并測序，并應(yīng)用在斑馬魚基因表達(dá)研究中廣泛使用的定位、半定量的全胚胎原位雜交(Whole mount in situhybridization，WISH)技術(shù)在mRNA水平上證明Hoxb4過表

6、達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系建系是否成功。同樣應(yīng)用WISH在轉(zhuǎn)錄水平篩選出Hoxb4過表達(dá)而引起的異常造血表面標(biāo)記物，進(jìn)而運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(retroversetranscription PCR，RT-PCR)進(jìn)行半定量分析，陽性表達(dá)細(xì)胞集落計數(shù)統(tǒng)計分析和雙色原位雜交的方法驗證。對不同表達(dá)量的Hoxb4基因?qū)τ谂咛ピ缙谠煅墓δ芎蜋C(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　結(jié)果:
　　從綠色熒光蛋白，DNA，mRNA三個水平上證實了在胚胎發(fā)育過程中的成血

7、成血管干細(xì)胞中過表達(dá)Hoxb4轉(zhuǎn)基因斑馬魚系建系成功。低表達(dá)Hoxb4會導(dǎo)致24-30 hpf期間，斑馬魚胚胎后部中間細(xì)胞群(intermediate cell mass，ICM)造血區(qū)域的stem cell leukemia(scl)和lmo2基因表達(dá)陽性的原始造血干細(xì)胞明顯上調(diào)的同時尾部血管內(nèi)皮細(xì)胞和節(jié)間血管的表面標(biāo)記物Flk1的表達(dá)下調(diào);但是在同一部位的紅系造血細(xì)胞的發(fā)生和成熟沒有受到影響;低表達(dá)的Hoxb4還可以使pu.1+髓祖

8、細(xì)胞擴(kuò)增，同時伴隨著成熟髓系細(xì)胞的標(biāo)記基因mpo和L-plastin表達(dá)在卵黃囊處的明顯減少。而在高表達(dá)純合Hoxb4轉(zhuǎn)基因系中，在26-28hpf時，該魚系胚胎的后部血島(posterior blood island，PBI)開始出現(xiàn)一個或多個由數(shù)個體積較大的細(xì)胞聚集而成的細(xì)胞團(tuán);在36hpf時約有12.5％的胚胎都在PBI區(qū)出現(xiàn)了同樣的細(xì)胞團(tuán)。通過WISH技術(shù)驗證該細(xì)胞是表面標(biāo)記物scl+/gata-1+/pu.1+的造血干細(xì)胞/紅

9、系祖細(xì)胞/髓系祖細(xì)胞群的細(xì)胞聚集體，同時該魚系的紅系、髓系的分化和血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育都受到了一定程度的阻滯。在4-5dpf，出現(xiàn)以上表型的胚胎死亡。
　　結(jié)論:
　　我們成功地建立了Hoxb4低表達(dá)量雜合和高表達(dá)純合的兩個斑馬魚系，為研究Hoxb4對早期胚胎造血的調(diào)控和機(jī)制提供了一個有力的活體動物模型。以上的結(jié)果表明在活體斑馬魚模型中，Hoxb4在活體成血成血管干細(xì)胞水平過表達(dá)的量適中時，其可引起瞬時原始造血干細(xì)胞和髓祖干細(xì)

10、胞的表面標(biāo)記物mRNA水平表達(dá)上調(diào)的同時延遲了尾部血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記物mRNA水平的表達(dá)和引起髓系分化的表面標(biāo)記物的mRNA水平的下調(diào);Hoxb4的表達(dá)量超過一定的限制會誘發(fā)造血干細(xì)胞和髓/紅系祖過度增生的同時抑制髓/紅系祖細(xì)胞向終末分化，最終可能導(dǎo)致造血干祖細(xì)胞過度“惡性”增殖;由于造血干祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞同時來源于共同的多能干細(xì)胞---成血成血管干細(xì)胞，兩者之間存在競爭性抑制關(guān)系，造血干祖細(xì)胞的增殖導(dǎo)致了血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育延遲

11、，這是在成血成血管干細(xì)胞水平過表達(dá)Hoxb4的活體動物模型中才可以獲得的表型。
　　第二部分 人成纖維細(xì)胞支持的人胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)全能性研究和染色體核型分析
　　目的:
　　本部分課題目的在于用畸胎瘤形成實驗驗證用飼養(yǎng)層細(xì)胞人包皮成纖維細(xì)胞(human postnatal foreskin fibroblasts，hPFF)支持生長的人胚胎干細(xì)胞hESC(human embryonic stem cell，hESC)具

12、有體內(nèi)全能性并對hESC進(jìn)行染色體核型分析。
　　方法:
　　將第20代的hESC和飼養(yǎng)層細(xì)胞hPFF分別接種到2只嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice，SCID)體內(nèi)，5周后接種hESC的小鼠有畸胎瘤形成，將畸胎瘤做成組織學(xué)切片驗證其是否包含了源于全部3個胚層的各種分化細(xì)胞。然后對再收集第20代hESC進(jìn)行染色體核型分析。
　　結(jié)果:
　　第20代

13、hESC細(xì)胞懸液接種后第5天即可在SCID小鼠接種部位觸到包塊，包塊進(jìn)行性增大。觀察5周后處死動物剝離瘤塊，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查顯示該腫塊包含3個胚層的組織結(jié)構(gòu)具備畸胎瘤的病理組織學(xué)特。hESC的染色體核型分析顯示均為正常二倍體核型。
　　結(jié)論:
　　hPFF可以作為飼養(yǎng)層和bFGF（basic fibroblast growth factor）的協(xié)同作用能支持hESC的生長;我們應(yīng)用的培養(yǎng)體系可以保持人胚胎干細(xì)胞體外未分化狀