環(huán)境雌激素雙酚A對成年小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、雙酚A(bisphenol A，BPA)大量使用于食品和飲料的碳酸聚酯包裝材料、樹脂內(nèi)膜和牙齒固封劑，以及各種化學(xué)日用品的添加材料。來自一些發(fā)達(dá)國家的調(diào)查顯示長期以來人們一直暴露于低劑量的BPA中。美國疾病控制中心的報(bào)告顯示，來自394份被測人群尿液樣本中有95％檢測出BPA。BPA是一種兼有擬雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它不僅可以低親和性與雌激素受體結(jié)合，還可與雄激素受體結(jié)合而干擾內(nèi)源性激素對腦的調(diào)節(jié)作用。目前大

2、部分關(guān)于BPA的研究大多集中在圍生期和發(fā)育期，對成年期的研究還很少，并且本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，圍生期和青春期BPA暴露影響子代小鼠的學(xué)習(xí)記憶、情感和多種社會(huì)行為及其性別分化。因此本研究將探討B(tài)PA暴露對成年期小鼠的影響。
　　海馬的突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶行為密切相關(guān)，雌激素可通過正向調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)環(huán)路聯(lián)系和突觸傳遞而促進(jìn)突觸可塑性。最近，有人發(fā)現(xiàn)BPA可以干擾性激素的突觸重塑作用。在大鼠和靈長類，BPA可抑制雌激素和雄激素誘導(dǎo)增

3、加的海馬和前皮層70-100％的棘突觸，BPA暴露數(shù)天促進(jìn)新生大鼠小腦蒲肯野氏細(xì)胞的樹突生長和下丘腦神經(jīng)元樹突密度。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)BPA快速增加體外海馬神經(jīng)元樹突絲密度和運(yùn)動(dòng)性。突觸界面是一個(gè)對行為訓(xùn)練和化學(xué)物質(zhì)非常敏感的結(jié)構(gòu)，其中的一些參數(shù)，如突觸間隙(synaptic cleft)、突觸前活性帶(synaptic activezone)、突觸后致密體(postsynaptic density, PSD)和突觸界面曲率(curva

4、ture of synaptic interface)可因刺激而發(fā)生改變。雌激素改善卵巢摘除小鼠記憶行為的同時(shí)伴隨有海馬和前皮層突觸界面結(jié)構(gòu)的變化，包括突觸間隙的縮小和PSD厚度增加。位于突觸后膜上的PSD含有細(xì)胞骨架和腳手架蛋白、谷氨酸受體、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、離子通道和信號(hào)分子等多種蛋白，這些蛋白表達(dá)的改變和相互作用均可影響突觸活性和可塑性，同時(shí)也改變PSD的厚度。那么，BPA影響成年神經(jīng)行為是否與突觸界面結(jié)構(gòu)修飾的改變有關(guān)呢？

5、>　　本研究通過將成年小鼠長期暴露于低劑量BPA，研究BPA對成年小鼠活動(dòng)性、探究、學(xué)習(xí)記憶等行為的影響，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸密度和突觸界面結(jié)構(gòu)的改變;進(jìn)一步通過Western blot檢測海馬突觸蛋白SynapsinⅠ和PSD-95(postsynaptic density protein of 95 kDa)，以及興奮性氨基酸NMDA和AMPA受體表達(dá)的改變，探討B(tài)PA影響行為和突觸結(jié)構(gòu)可塑性的機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)8

6、周齡ICR雌雄小鼠，雄性體重30-35g，雌性體重25-30g，購于浙江省金華市藥檢所。小鼠雌雄分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12h交替，飼養(yǎng)室溫度控制在18-22C，濕度在50％-60％，水和食物自由攝取。小鼠適應(yīng)2周后，隨機(jī)分為BPA暴露組(0.4，4，40mg/kg/day)(BPA，99.8％，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)和溶媒對照組（金龍魚食用油）。每天上午8點(diǎn)灌胃染毒，持續(xù)12周。染毒結(jié)束3天后，按順序分別檢測開場行為，水迷

7、宮和被動(dòng)回避。另取小鼠進(jìn)行分別做超薄切片電鏡觀察海馬突觸界面結(jié)構(gòu)、蛋白免疫印跡(western-blot)技術(shù)檢測海馬NMDA受體NR1和AMPA受體GluR1亞基表達(dá)和突觸蛋白PSD-95和Synapsin-1表達(dá);同時(shí)檢測體重、血清雌激素、雄激素水平。
　　所得的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS18.0軟件包，水迷宮四天訓(xùn)練結(jié)果采用重復(fù)三因素(BPA暴露×性別×訓(xùn)練天數(shù))方差分析(three-way ANOVA)，其它行

8、為結(jié)果、體重和突觸形態(tài)測算采用重復(fù)雙因素(BPA暴露×性別)方差分析(two-way ANOVA)，生殖器官系數(shù)、血清激素水平和Western blot結(jié)果用單因素(BPA暴露)方差分析(one-way ANOVA)。然后進(jìn)行事后檢驗(yàn)(Post-hoc test，LSD)。P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性。
　　結(jié)果:
　　1.BPA暴露前(10周齡)小鼠體重沒有明顯的性別差異，隨后，雄鼠的體重增長加速，到22.5周齡時(shí)

9、，雄鼠體重明顯高于雌鼠，與同性別對照組相比，0.4和40 mg/kg/day BPA暴露12周顯著增加雄鼠的體重(p＜0.05)。BPA暴露對雌、雄小鼠生殖器官/體重比、雌鼠血清和腦內(nèi)雌二醇水平均沒有顯著影響，但0.4和4 mg/kg/day BPA顯著降低雄鼠血清和腦的睪酮水平(p＜0.05)。
　　2.開場行為結(jié)果表明:一分鐘跑格數(shù)雌雄組內(nèi)均沒有差異，而雄性在一分鐘跑格數(shù)據(jù)中顯著高于雌性(0，0.4，40mg/kg/d，p＜0

10、.05)，而測試五分鐘跑格數(shù)得出，雌雄小鼠組內(nèi)組間都沒有差異，BPA暴露消除了小鼠在五分鐘跑格數(shù)中的性別差異。BPA暴露(0.4、4、40mg/kg/day)增加雄性的站立次數(shù)和理毛頻率，BPA(4mg/kg/day)卻顯著減少雌鼠的站立次數(shù)。在4天的水迷宮訓(xùn)練中，各組小鼠的游泳平均速度沒有明顯差異，但每天探索平臺(tái)的平均距離表現(xiàn)為隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短，說明各組小鼠都具有一定的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，但正常雌鼠探索平臺(tái)所需的平均距離要大于雄

11、鼠(第3、4天，P＜0.05)，表明正常狀態(tài)下雄鼠具有更好的空間學(xué)習(xí)記憶能力。BPA暴露顯著延長雄鼠搜索平臺(tái)的平均距離(P＜0.05），但對雌鼠沒有影響。表明長期BPA暴露性別特異性地?fù)p傷成年雄鼠的空間記憶能力，并因此消除空間學(xué)習(xí)記憶的性別差異。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:電擊前，各組小鼠步下平臺(tái)的潛伏期沒有差異，均可在5sec內(nèi)跳下平臺(tái)。電擊后24h，各組小鼠步下平臺(tái)潛伏期均顯著延長，并表現(xiàn)出性別差異(P＜0.001，雄鼠＞雌鼠)。與同性別對照

12、組相比，40mg/kg/day BPA明顯縮短了雄鼠電擊后的步下潛伏期(P＜0.05）;表明長期BPA暴露性別特異性地?fù)p傷成年雄鼠的被動(dòng)回避記憶能力，并因此消除其性別差異。
　　3.突觸數(shù)密度和突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)檢測結(jié)果顯示0.4和40mg/kg/day BPA暴露顯著降低了雄鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)密度（P＜0.01），并因此誘導(dǎo)成年小鼠海馬CA區(qū)突觸密度的性別差異(P＜0.01，雄鼠＜雌鼠)。與同性別對照組相比，BPA顯著加寬雄鼠海

13、馬的突觸間隙寬度(P＜0.05，P＜0.01)，縮短其活性帶長度(0.4mg/kg/day，P＜0.05)，并減小PSD厚度(0.4、40mg/kg/day，P＜0.05)，但對雌鼠沒有影響。以上結(jié)果表明長期BPA暴露主要影響成年雄鼠的突觸形成和結(jié)構(gòu)修飾，該結(jié)果與BPA對記憶行為的影響相一致。
　　4.進(jìn)一步分析BPA損傷學(xué)習(xí)記憶和突觸形成的機(jī)制，本研究采用Westernblot分析了長期BPA暴露后，海馬突觸標(biāo)志性蛋白和谷氨酸N

14、MDA和AMPA受體表達(dá)的變化。結(jié)果表明，BPA暴露性別特異性地抑制突觸蛋白和受體的表達(dá)，主要表現(xiàn)為3個(gè)劑量BPA均下調(diào)雄鼠SynapsinⅠ和PSD-95表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，0.4和40mg/kg/day BPA下調(diào)NMDA受體NR1亞基表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，但對雌鼠的這些蛋白沒有明顯影響。以上結(jié)果提示成年雄鼠海馬的突觸蛋白和NMDA受體對BPA更為敏感，該結(jié)果與BPA引起的突觸形成和結(jié)構(gòu)變化相一致的。<