新信號(hào)分子SH2A相互作用的蛋白質(zhì)篩選.pdf

1、目的： 蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)——細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是研究細(xì)胞利用“生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)”對(duì)外界刺激做出反應(yīng)的分子機(jī)制。這個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)如同細(xì)胞的神經(jīng)系統(tǒng)，控制著正常生物細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失控可導(dǎo)致許多人類(lèi)疾病，已經(jīng)成為生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，并對(duì)未來(lái)藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。因此，蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的主要內(nèi)容而被廣泛關(guān)注，許多研究蛋白質(zhì)問(wèn)相互作用的方法應(yīng)運(yùn)而生，其中酵母雙雜交技術(shù)是目

2、前應(yīng)用最廣泛的用于研究已知和未知蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)功能域、蛋白質(zhì)與小分子間相互作用以及藥物靶點(diǎn)篩選和設(shè)計(jì)的方法。 本實(shí)驗(yàn)室利用外顯子捕獲和外顯子拼接技術(shù)在富含疾病基因的人染色體8p22區(qū)域克隆的新基因——SH2A，應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件(SMART)分析顯示其編碼產(chǎn)物具有一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)其是SH2信號(hào)蛋白家族成員之一。SH2結(jié)構(gòu)域是一種廣泛存在于蛋白質(zhì)的結(jié)合基序，結(jié)構(gòu)高度保守，特異識(shí)別磷酸化酪氨酸殘基，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組件，主要參與酪氨酸蛋白激酶相關(guān)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，是上游與下游信號(hào)分子聯(lián)系的分子基礎(chǔ)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程的調(diào)節(jié)，并與某些疾病的發(fā)生關(guān)系密切。因此研究含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在生理和病理?xiàng)l件下的作用機(jī)制，將為臨床藥物開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)。前期工作中，已經(jīng)將SH2A亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且研究發(fā)現(xiàn)野生型SH2A能夠強(qiáng)烈抑制細(xì)胞蛋白激酶C(PKC)活性，而缺失型載體對(duì)細(xì)胞的PKC活性幾乎沒(méi)有影響，提示SH2A可能阻

4、止了PKC信號(hào)通路向下傳遞。迄今為止，SH2A的確切生物學(xué)功能尚不清楚。 為了深入研究SH2A的生物學(xué)功能，明確其在信號(hào)傳導(dǎo)通路中與其他蛋白質(zhì)的相互作用，本實(shí)驗(yàn)利用酵母雙雜交系統(tǒng)，用體外構(gòu)建的pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重組表達(dá)載體篩選人類(lèi)腎臟cDNA文庫(kù)，初步篩選出與SH2A相互作用的五種蛋白質(zhì)，從而為進(jìn)一步研究SH2A在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生物學(xué)功能提供了信息。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、構(gòu)建pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重