新信號分子SH2A相互作用的蛋白質(zhì)篩選.pdf

1、目的： 蛋白質(zhì)問的相互作用形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)——細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是研究細(xì)胞利用“生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)”對外界刺激做出反應(yīng)的分子機制。這個復(fù)雜的細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)如同細(xì)胞的神經(jīng)系統(tǒng)，控制著正常生物細(xì)胞的生長、分化和凋亡。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的失控可導(dǎo)致許多人類疾病，已經(jīng)成為生物學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域，并對未來藥物的開發(fā)具有重要意義。因此，蛋白質(zhì)問的相互作用作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的主要內(nèi)容而被廣泛關(guān)注，許多研究蛋白質(zhì)問相互作用的方法應(yīng)運而生，其中酵母雙雜交技術(shù)是目

2、前應(yīng)用最廣泛的用于研究已知和未知蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)功能域、蛋白質(zhì)與小分子間相互作用以及藥物靶點篩選和設(shè)計的方法。 本實驗室利用外顯子捕獲和外顯子拼接技術(shù)在富含疾病基因的人染色體8p22區(qū)域克隆的新基因——SH2A，應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件(SMART)分析顯示其編碼產(chǎn)物具有一個SH2結(jié)構(gòu)域，因此推測其是SH2信號蛋白家族成員之一。SH2結(jié)構(gòu)域是一種廣泛存在于蛋白質(zhì)的結(jié)合基序，結(jié)構(gòu)高度保守，特異識別磷酸化酪氨酸殘基，是細(xì)胞內(nèi)信號

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組件，主要參與酪氨酸蛋白激酶相關(guān)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是上游與下游信號分子聯(lián)系的分子基礎(chǔ)，參與細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程的調(diào)節(jié)，并與某些疾病的發(fā)生關(guān)系密切。因此研究含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在生理和病理條件下的作用機制，將為臨床藥物開發(fā)提供重要依據(jù)。前期工作中，已經(jīng)將SH2A亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且研究發(fā)現(xiàn)野生型SH2A能夠強烈抑制細(xì)胞蛋白激酶C(PKC)活性，而缺失型載體對細(xì)胞的PKC活性幾乎沒有影響，提示SH2A可能阻

4、止了PKC信號通路向下傳遞。迄今為止，SH2A的確切生物學(xué)功能尚不清楚。 為了深入研究SH2A的生物學(xué)功能，明確其在信號傳導(dǎo)通路中與其他蛋白質(zhì)的相互作用，本實驗利用酵母雙雜交系統(tǒng)，用體外構(gòu)建的pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重組表達(dá)載體篩選人類腎臟cDNA文庫，初步篩選出與SH2A相互作用的五種蛋白質(zhì)，從而為進一步研究SH2A在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生物學(xué)功能提供了信息。 實驗方法： 1、構(gòu)建pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重