新信號分子SH2A相互作用的蛋白質篩選.pdf

1、目的： 蛋白質問的相互作用形成的復雜網(wǎng)絡——細胞信號轉導，是研究細胞利用“生物信號轉導網(wǎng)絡”對外界刺激做出反應的分子機制。這個復雜的細胞信號網(wǎng)絡如同細胞的神經(jīng)系統(tǒng)，控制著正常生物細胞的生長、分化和凋亡。細胞信號轉導的失控可導致許多人類疾病，已經(jīng)成為生物學研究的一個重要領域，并對未來藥物的開發(fā)具有重要意義。因此，蛋白質問的相互作用作為信號轉導研究的主要內容而被廣泛關注，許多研究蛋白質問相互作用的方法應運而生，其中酵母雙雜交技術是目

2、前應用最廣泛的用于研究已知和未知蛋白質相互作用、蛋白質功能域、蛋白質與小分子間相互作用以及藥物靶點篩選和設計的方法。 本實驗室利用外顯子捕獲和外顯子拼接技術在富含疾病基因的人染色體8p22區(qū)域克隆的新基因——SH2A，應用蛋白質結構分析軟件(SMART)分析顯示其編碼產(chǎn)物具有一個SH2結構域，因此推測其是SH2信號蛋白家族成員之一。SH2結構域是一種廣泛存在于蛋白質的結合基序，結構高度保守，特異識別磷酸化酪氨酸殘基，是細胞內信號

3、轉導的重要組件，主要參與酪氨酸蛋白激酶相關受體介導的信號轉導過程，是上游與下游信號分子聯(lián)系的分子基礎，參與細胞的生長、增殖和分化等過程的調節(jié)，并與某些疾病的發(fā)生關系密切。因此研究含有SH2結構域的蛋白質在生理和病理條件下的作用機制，將為臨床藥物開發(fā)提供重要依據(jù)。前期工作中，已經(jīng)將SH2A亞細胞定位在細胞質中，并且研究發(fā)現(xiàn)野生型SH2A能夠強烈抑制細胞蛋白激酶C(PKC)活性，而缺失型載體對細胞的PKC活性幾乎沒有影響，提示SH2A可能阻

4、止了PKC信號通路向下傳遞。迄今為止，SH2A的確切生物學功能尚不清楚。 為了深入研究SH2A的生物學功能，明確其在信號傳導通路中與其他蛋白質的相互作用，本實驗利用酵母雙雜交系統(tǒng)，用體外構建的pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重組表達載體篩選人類腎臟cDNA文庫，初步篩選出與SH2A相互作用的五種蛋白質，從而為進一步研究SH2A在信號轉導中的生物學功能提供了信息。 實驗方法： 1、構建pGBKT7-SH2A誘餌蛋白重