子癇前期患者血漿對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長活性的影響及其與溶血磷脂酸受體的關(guān)系.pdf

1、背景與目的：
　　 子癇前期(preeclampsia，PE)是孕婦特有疾病，發(fā)病率高達(dá)3％～10％，臨床上缺乏有效的檢測指標(biāo)和治療手段，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。有關(guān)子癇前期病因和發(fā)病機(jī)制的學(xué)說有多種，包括滋養(yǎng)細(xì)胞侵入和胎盤血管重鑄異常、血管內(nèi)皮損傷、凝血纖溶機(jī)制異常、免疫機(jī)制異常及營養(yǎng)不良等，但至今為止沒有一種學(xué)說能很好的解釋該病的所有臨床現(xiàn)象，給予癇前期的預(yù)防及治療帶來巨大困難。大量研究表明，子癇前期最基本的

2、病理改變是全身小動脈痙攣，導(dǎo)致全身各系統(tǒng)各器官血液灌流減少，組織缺血缺氧，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血液異常高凝狀態(tài)，造成重要臟器如胎盤、腎臟、肝臟、心腦等器官功能障礙，嚴(yán)重威脅母胎生命。國內(nèi)外許多研究證實血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血液高凝狀態(tài)在絕大多數(shù)重度子癇前期和子癇患者中存在，并認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，但內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因及機(jī)制至今未明。有學(xué)者提出，子癇前期孕婦的血液中含有細(xì)胞毒性因子，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，但毒性因子的性

3、質(zhì)來源仍不清楚。如果能清楚其性質(zhì)、作用、產(chǎn)生部位及調(diào)節(jié)機(jī)制，或許能發(fā)現(xiàn)敏感的疾病監(jiān)測指標(biāo)和治療靶點，有助于疾病的早期診斷和治療，從而有效阻止疾病的進(jìn)展，改善子癇前期患者的不良預(yù)后。
　　 本課題組前期研究顯示，子癇前期患者血漿溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid，LPA)水平明顯升高，其胎盤組織中LPA受體—內(nèi)皮分化基因2、4、7（endothelialdifferentiationgene-2、4、7，Edg2

4、、4、7）表達(dá)水平明顯升高，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，但LPA是否參與子癇前期孕婦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其機(jī)制的研究報道鮮見。本研究通過生化法測定60例子癇前期患者血漿及30例健康孕婦血漿LPA水平，用含體積分?jǐn)?shù)為20％的子癇前期患者血漿和健康孕婦血漿預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)48h后，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)和流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的增殖及凋亡情

5、況，免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測各組細(xì)胞中Edg2、4、7蛋白的表達(dá)，探討子癇前期患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與LPA及其受體的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.選擇2011年10月-2012年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院入院分娩的子癇前期孕婦60例，其中輕度子癇前期組30例，年齡（30.9±4.5）歲，孕周（36.7±2.8）周;重度子癇前期組30例，年齡（31.6±5.7）歲，孕周（34.3±4.1）周，子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)按樂杰主編

6、的全國統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版中的標(biāo)準(zhǔn)。另選取同期入院分娩的健康孕婦30例為健康孕婦組，年齡(27.9±2.0)歲，孕周(39.0±0.5)周，3組孕婦均無其他系統(tǒng)并發(fā)癥及合并癥。
　　 2、實驗方法
　　 孕婦入院后經(jīng)知情同意，采集靜脈血10ml，離心后分離血漿，放-20℃保存?zhèn)溆?。采用生化法測定各組孕婦血漿LPA水平;對體外培養(yǎng)的HUVECs中加入含體積分?jǐn)?shù)為20％的各組孕婦血漿進(jìn)行預(yù)處理，另設(shè)一個空白的對照組。應(yīng)

7、用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)和AnnexingV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的增殖及凋亡情況;免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測各組細(xì)胞中Edg2、4、7蛋白的表達(dá)。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(x)±s表示，定性資料采用x2檢驗，定量資料采用單因素方差分析（方差齊）和Kruskal-Wallis檢驗（方差不齊），兩兩比較采用LSD-t檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)

8、。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組孕婦血漿LPA水平
　　 健康孕婦組血漿LPA水平為（3.38±2.08）μmol/L，輕度PE組為（6.12±0.22）μmol/L，重度PE組為（9.10±0.17）μmol/L，輕、重度PE組血漿LPA水平明顯高于健康孕婦組。3組間LPA水平比較統(tǒng)計學(xué)差異顯著(F=6163.92，P＜0.01)，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、各組HUVECs增殖

9、能力
　　 輕、重度PE組孕婦血漿孵育HUVECs48h后，倒置相差顯微鏡下可見，細(xì)胞形態(tài)由長梭形或多邊形改變?yōu)闄E圓或圓形，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞排列變疏松;健康孕婦組和對照組細(xì)胞形態(tài)基本正常無變化。用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況，PE組HUVECs的吸光度A值明顯低于健康孕婦組和對照組，細(xì)胞增殖受到抑制，重度PE組較輕度PE組抑制更明顯。各組間A值及增殖率的比較差異顯著（F=734.92，P＜0.01;F=936.10，P＜0.0

10、1），兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、各組HUVECs凋亡率
　　 各組細(xì)胞用孕婦血漿預(yù)處理48小時后，用AnnexingV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，輕、重度PE組HUVECs早期凋亡率、中晚期凋亡率以及總凋亡率均明顯高于健康孕婦及對照組。各組間總凋亡率、早期凋亡率、中晚期凋亡率比較差異顯著(H=111.57，P＜0.01;H=110.95，P＜0.01;H=111.58，P＜

11、0.01)，4組間總凋亡率兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、各組孕婦Edg2、4、7蛋白表達(dá)陽性率
　　 LPA受體Edg2、4、7蛋白均表達(dá)于HUVECs的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，鏡下可見由淺至深的棕黃色染色顆粒，且輕、重度PE組HUVECs中Edg2、4、7蛋白陽性表達(dá)結(jié)果顯示，Edg2＞Edg4＞Edg7，但分別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=2.96，P＞0.05;x2=2.31，P＞0.05;x2=2.

12、78，P＞0.05)。輕、重度子癇前期組Edg2、4、7蛋白表達(dá)陽性率均明顯高于對照組和健康孕婦組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.子癇前期患者血漿LPA水平明顯升高，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示LPA可能是血液中的一種細(xì)胞毒性因子，在子癇前期的發(fā)病過程中起一定作用。
　　 2.子癇前期患者血漿有抑制HUVECs增殖、促進(jìn)其凋亡作用，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示子癇前期患者血