IgA腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞活化與凋亡及雷公藤甲素干預(yù)研究.pdf

1、IgA腎病IgA nephropathy，IgAN)是一類以反復(fù)發(fā)作性肉眼血尿或鏡下血尿，腎小球系膜區(qū)IgA沉積為特征的原發(fā)性腎小球疾病。免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子是IgAN發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和一氧化氮(nitricoxide,NO)是免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成分，被認(rèn)為是各種腎小球腎炎疾病中導(dǎo)致或加

2、重腎臟損傷的重要物質(zhì)。大量實(shí)驗(yàn)證明淋巴細(xì)胞凋亡與自身免疫性疾病發(fā)病相關(guān)，研究表明轉(zhuǎn)染人Bc1-2導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡缺陷的(NZW×B6)F1-hbc1-2Tg小鼠可發(fā)展為高IgA免疫球蛋白血癥和IgAN。因此IgANPBMC中炎癥介質(zhì)及凋亡情況在發(fā)病機(jī)制中所起的作用值得進(jìn)一步研究。
　　 雷公藤多甙(TripterygiumWilfordiiHookf)因其獨(dú)特的抗炎及免疫抑制效應(yīng)已廣泛應(yīng)用于治療以系膜增生為主的IgAN，其療效已被

3、大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。它不僅可以使腎臟病變減輕，而且可使血尿減輕以至消失，但其治療IgAN的具體機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究，其對(duì)IgAN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的作用尚未見報(bào)道。雷公藤甲素(triptolide,TP)是從雷公藤中分離得到的二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表達(dá)與凋亡情況，以及

4、TP對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　 第一章IgA腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NO及其相關(guān)性研究
　　 目的：研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表達(dá)情況，探討其與發(fā)病機(jī)制的關(guān)系及免疫紊亂程度與臨床資料之間的關(guān)系。
　　 方法：臨床和病理確診的IgAN患者29例，以及健康體檢者16名，分離IgAN患者和正常對(duì)照組PBMC，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PBMC中TNF-α、IL-6mRNA的表

5、達(dá)水平，同時(shí)分離血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測(cè)定其中TNF-α、IL-6的濃度，用硝酸還原酶法(Griess法）檢測(cè)其NO的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)較正常人顯著增加(P＜0.05；P＜0.01)；
　　 2.IgAN患者血漿TNF-α、IL-6、NO濃度明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，且三者含量均呈正相關(guān)。
　　 3.IgANL

6、ee氏分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者血漿TNF-α、IL-6、NO含量高于Lee氏Ⅰ、Ⅱ級(jí)，腎功能受損(Ccr＜60ml/mim)患者血漿TNF-α、IL-6含量高于非腎功能受損患者(Ccr＞60ml/mim)，NO含量低于非腎功能受損患者。
　　 4.相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，24h尿蛋白排泄量與血漿TNF-α濃度正相關(guān)(r＝0.27,P＜0.05)，腎臟病理損害程度與血漿TNF-α、IL-6、NO濃度正相關(guān)(r＝0.56,P＜0.01;r＝0.38

7、,P＜0.05;r＝0.31,P＜0.05)，血尿、血IgA和C3水平與血漿TNF-α、IL-6、NO濃度均無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：IgAN患者體內(nèi)存在促炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6、NO生成增高，并在其疾病進(jìn)展中起到重要作用。
　　 第二章：IgA腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡情況及其相關(guān)蛋白表達(dá)
　　 目的：探討PBMC凋亡及其調(diào)控蛋白在IgAN發(fā)病機(jī)制中作用。
　　 方法：應(yīng)用AnnexinV-FIT

8、C凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測(cè)IgAN患者及正常人PBMC凋亡率，并采用WestenBlot方法檢測(cè)IgAN患者及正常人PBMC中凋亡調(diào)控蛋白Bc1-2、Bax表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.IgAN患者PBMC早期凋亡率較正常對(duì)照組增多(P＜0.01)，24小時(shí)尿蛋白量＞1gIgAN患者組PBMC早期凋亡率高于24小時(shí)尿蛋白量＜1g組，IgAN患者PBMC早期凋亡率與其血漿TNF-α、IL-6含量明顯相關(guān)(TNF

9、-α/凋亡率：t＝2.79，P＜0.05；IL-6/凋亡率：t＝2.77，P＜0.05)，與血尿、血IgA、血C3水平以及腎臟病理損害程度無相關(guān)性；
　　 2.IgAN患者組Bc1-2蛋白的平均相對(duì)表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.09)；
　　 3.IgAN患者與正常人對(duì)照組PBMC中Bax蛋白平均相對(duì)表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：IgAN患者PBMC早期凋亡率增高可

10、能繼發(fā)于體內(nèi)免疫紊亂，并參與IgAN發(fā)病。凋亡抑制蛋白Bc1-2高表達(dá)可能導(dǎo)致自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，產(chǎn)生過多的IgA抗體，從而導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)IgA沉積增多和IgAN的發(fā)生。
　　 第三章：雷公藤甲素對(duì)IgA腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞抑制作用研究
　　 目的：觀察雷公藤甲素(triptolide，TP)對(duì)體外培養(yǎng)IgAN患者PBMC免疫抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。
　　 方法：體外分離、培養(yǎng)IgAN患者PBMC

11、，采用四唑鹽比色(MTT)間接法觀察TP在不同時(shí)間段和不同劑量下殺傷活性的變化。培養(yǎng)PBMC，分為陰性對(duì)照組、PHA(10μg/ml)模型組和PHA(10μg/ml)＋TP(12.5ng/ml、25ng/ml)處理組，采用定量Realtime-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-6在基因水平表達(dá)的變化，用硝酸還原酶法（Griess法）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清NO的含量變化，酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況。應(yīng)用流

12、式細(xì)胞儀，AnnexinV-FITC雙染色分析TP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，RT-PCR、WesternBlot方法檢測(cè)PBMC中Bc1-2、Bax、Caspase9、Caspase3基因和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT結(jié)果顯示，在0、5、10、20、40、80ng/ml及24h、48h、72h之內(nèi)TP對(duì)IgAN患者PBMC具有生長(zhǎng)抑制作用，呈濃度和時(shí)間依賴性；
　　 2.12.5ng/ml和25ng/

13、ml濃度TP對(duì)PBMC作用24h后能明顯抑制TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)(P＜0.01)，且基因表達(dá)水平與TP濃度之間存在負(fù)相關(guān)(TNF-α:r＝－0.98,P＜0.01;IL-6:r＝－0.93,P＜0.01)，TP作用24h后，IgAN患者PBMC培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、NO含量明顯減低(P＜0.01)，蛋白分泌量與TP濃度之間存在負(fù)相關(guān)(TNF-α:r＝-0.95,P＜0.01;IL-6:r＝－0.98,P＜0.01

14、;NO:r＝－0.91,P＜0.01)；
　　 3.PHA＋TP(12.5ng/ml、25ng/ml)處理組細(xì)胞凋亡率較PHA模型組明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度正相關(guān)(r＝0.89,P＜0.01)；RT-PCR、WesternBlot方法檢測(cè)表明，隨處理組所加TP濃度增大，PBMC內(nèi)細(xì)胞內(nèi)源性Bc1-2表達(dá)逐漸降低(P＜0.05)，Bax、caspase3、caspase9表達(dá)逐漸增加(P＜0

15、.05)，并且WesternBlot觀察到Caspase9、Caspase3激活帶隨TP濃度的增加明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：TP能有效抑制IgAN患者PBMCTNF-α、IL-6、NO的表達(dá)和分泌；TP可以誘導(dǎo)IgAN患者PBMC凋亡，此作用可能通過線粒體途徑以及改變Bc1-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 全文總結(jié)：
　　 1.證實(shí)IgAN患者體內(nèi)存在炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6、NO生成

16、增高，體內(nèi)淋巴細(xì)胞處于高活性狀態(tài)，并在其疾病進(jìn)展中起到重要作用。
　　 2.證實(shí)IgAN患者PBMC早期凋亡率增高，結(jié)合前期研究可能繼發(fā)于體內(nèi)免疫紊亂，并參與IgAN發(fā)病過程。凋亡抑制基因蛋白Bc1-2高表達(dá)，可能導(dǎo)致自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，產(chǎn)生過多的IgA抗體，從而導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)IgA沉積增多和IgAN的發(fā)生。
　　 3.證實(shí)TP能有效抑制IgAN患者PBMCTNF-α、IL-6、NO的生成和分泌；TP可誘