RA-RARa、BATF對IgA腎病患者扁桃體單個核細(xì)胞IgA類別轉(zhuǎn)換的調(diào)控研究.pdf

1、IgA腎病(immunoglobulin A nephrology,IgAN)是一組由多病因引起的具有相同免疫病理學(xué)特征的慢性腎小球疾病,以系膜區(qū)異常糖基化IgA沉積為主要病理表現(xiàn)。臨床上主要表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、高血壓及腎功能損害。IgA腎病發(fā)病率居于原發(fā)性腎小球疾病的首位。約20％-40％的患者將進(jìn)入慢性腎功能衰竭。然而IgAN發(fā)病機(jī)制尚未闡明。IgAN中腎臟沉積的IgA以多聚體IgA1亞型(pIgA1)為主。IgA1分子異常合成是I

2、gA分子在翻譯后水平發(fā)生異常糖基化的基礎(chǔ),也是由此種異常糖基化IgA1誘發(fā)腎臟損傷這一多米諾效應(yīng)的起始階段。黏膜免疫系統(tǒng)是體內(nèi)IgA合成與分泌的重要場所,扁桃體作為黏膜免疫的重要組成部分,其免疫功能異常與IgAN發(fā)病密切相關(guān)。IgAN患者腎臟洗脫的IgA抗體可與該患者扁桃體細(xì)胞特異性結(jié)合,扁桃體切除術(shù)能有效降低IgAN患者循環(huán)池中IgA的水平及腎臟IgA1的沉積量。這說明腎臟沉積的IgA1至少部分來源于扁桃體。已有研究證實,在某些微生物

3、抗原的刺激下,扁桃體單個核細(xì)胞能上調(diào)激活誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶(activationinduced cytidine deanase,AID)這一免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(classswitch recombination,CSR)關(guān)鍵酶的表達(dá),增強(qiáng)CSR,導(dǎo)致B細(xì)胞合成的抗體在保持原有抗原特異性的同時發(fā)生類或亞類的轉(zhuǎn)換。CSR這種生物學(xué)機(jī)制,改變了免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū),使B細(xì)胞由最初合成IgM或IgD,轉(zhuǎn)為合成IgG,IgA或IgE。免疫球蛋

4、白重鏈CH區(qū)局部基因片段轉(zhuǎn)錄形成的一個germline的轉(zhuǎn)錄本稱Ig胚系轉(zhuǎn)錄(germline transcription,GT),IgA對應(yīng)的GT為Iα-Cα。GT可與lg基因組形成不穩(wěn)定的三聚體,從而保持基因局部的開放狀態(tài),使其得以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。CSR過程并未改變重鏈的可變區(qū),這樣既保證免疫球蛋白針對同一抗原又能使免疫球蛋白參與多種效應(yīng)途徑。經(jīng)CSR合成的IgA中90％為IgA1。IgA1類別轉(zhuǎn)換的發(fā)生使得局部及循環(huán)中IgA1水平增加

5、,為低糖基化IgA1更多的在腎臟沉積提供了可能。
　　多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換。TGF-β,IL-5和IL-6參與調(diào)節(jié)IgA的類別轉(zhuǎn)換。維甲酸(rentinoic acid RA)是維生素A代謝的中間產(chǎn)物,能為樹突狀細(xì)胞(dendritic cellsDC),腸道上皮細(xì)胞（epithelial cell,EC）等細(xì)胞所分泌,通過與核受體RAR,RXR結(jié)合來調(diào)節(jié)免疫,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝及凋亡。RA效應(yīng)的發(fā)揮受到

6、靶細(xì)胞類型及細(xì)胞所處微環(huán)境的影響,這可能與RA受體分布具有一定的組織差異性及RA發(fā)揮時所處細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不同相關(guān)。在腸道派氏結(jié)中(Peyer's patches,PP),RA能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖并表達(dá)歸巢受體,促進(jìn)B細(xì)胞向IgA+漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但RA/RAR通路在扁桃體中的表達(dá)情況,及其與IgAN發(fā)病的關(guān)系未見報導(dǎo)。
　　堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子BATF(basic leucinezippertranscription factor)屬于

7、AP(activator protein)超家族。BATF廣泛表達(dá)于免疫組織,介導(dǎo)Th17、Th2、Tfh的細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換。在腸道粘膜免疫系統(tǒng)中,BATF作為必要條件,參與RA誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞歸巢信號的表達(dá)。但在扁桃體中BATF表達(dá)如何;是否能推進(jìn)扁桃體單個核細(xì)胞免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換向IgA生成的方向發(fā)展;以及作為轉(zhuǎn)錄因子,是否與RA/RAR通路存有交互作用值得探討。
　　臨床上,IgA腎病患者常表現(xiàn)出與

8、粘膜組織感染相一致的病情反復(fù)與進(jìn)展。尤以上呼吸道感染后肉眼血尿加重最為常見。IgA腎病的發(fā)生與黏膜組織對外來抗原免疫應(yīng)答紊亂密切相關(guān)。我們前期的研究證實,革蘭氏陽性菌中的甲型溶血性鏈球菌是慢性扁桃體炎及IgAN患者扁桃體中的主要菌種,脂多糖則是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的共同主要抗原成分。本課題采用滅活的甲型溶血性鏈球菌和脂多糖作為干預(yù)手段,體外模擬上呼吸道感染對扁桃體的刺激作用,觀察扁桃體單個核細(xì)胞RA/RAR、BATF表達(dá)的變化,分析其與I

9、gA類別轉(zhuǎn)換的關(guān)系,為IgA腎病防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點。
　　第一章：RA/RARα在腭扁桃體中的表達(dá)及與IgA1、IgA腎病臨床指標(biāo)相關(guān)性的研究
　　目的:
　　檢測腭扁桃體RA/RARα表達(dá),分析RA/RARα與IgA1水平及IgA腎病患者eGFR、蛋白尿、血尿的關(guān)系。
　　方法:
　　收集經(jīng)臨床和腎活檢確診為IgA腎病患者的腭扁桃體20例做為觀察組（IgAN組）,慢性扁桃體炎非腎炎患者22例作

10、為對照組（CT組）。免疫組織化學(xué)檢測腭扁桃體組織RARα的表達(dá)水平;密度梯度離心法分離腭扁桃體單個核細(xì)胞,采用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測RARαmRNA和蛋白表達(dá)水平;ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中RA、IgA1含量;分析RA、RARα與IgAN組eGFR、蛋白尿、血尿的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果顯示;扁桃體RARα表達(dá)主要集中在淋巴小結(jié)生發(fā)中心和扁桃體上皮層。與對照組比較,IgAN組R

11、ARα在上述部位表達(dá)明顯增加。
　　2.RT-PCR及Western blot結(jié)果均提示IgAN組RARαmRNA和蛋白表達(dá)較CT組升高。
　　3.IgAN組腭扁桃體單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清IgA1水平,RA水平較CT組明顯升高。
　　4.相關(guān)性分析提示IgAN腭扁桃體單個核細(xì)胞RA、RARα表達(dá)水平與eGFR呈負(fù)相關(guān),與IgA1、蛋白尿、血尿水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　RA/RARα信號通路在IgAN患者腭

12、扁桃體中處于激活狀態(tài);免疫組化、RT-PCR及Western blot結(jié)果均證實了IgAN患者腭扁桃體RARα的高表達(dá)。且RA/RARα與IgA1及IgAN主要臨床指標(biāo)密切相關(guān)。提示RA/RARα可能通過促進(jìn)IgA1的產(chǎn)生參與IgAN的致病,并在IgAN發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮作用。
　　第二章：RARα、BATF與IgA1類別轉(zhuǎn)換相關(guān)基因AID、Ia-Ca相關(guān)性的研究
　　目的:
　　觀察BATF在腭扁桃體中的表達(dá)情況及與Ig

13、A1表達(dá)水平的相關(guān)性,分析RARα、BATF與IgA1類別轉(zhuǎn)換基因AID、Ia-Ca胚系轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)性。
　　方法:
　　收集IgA腎病組及對照組腭扁桃體。免疫組織化學(xué)檢測腭扁桃體組織BATF的表達(dá)水平;密度梯度離心法分離腭扁桃體單個核細(xì)胞,采用RT-PCR技術(shù)分別檢測BATF、AID、Ia-Ca mRNA水平;Western blot檢測BATF、AID蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清IgA1含量。以第一章節(jié)所測

14、RARαmRNA及蛋白表達(dá)值,與AID、Ia-Ca行相關(guān)性分析,并分析BATF與AID、Ia-Ca、IgA1的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:BATF表達(dá)主要集中在扁桃體淋巴小結(jié)生發(fā)中心和扁桃體上皮層;與對照組比較,IgAN組BATF在上述部位表達(dá)明顯增加。
　　2.RT-PCR結(jié)果提示IgAN組BATF、AID、Ia-Ca mRNA表達(dá)較CT組升高。Western blot顯示IgAN組BATF、AI

15、D蛋白表達(dá)水平較CT組升高。
　　3.采用Pearson相關(guān)分析及直線回歸,發(fā)現(xiàn)IgAN腭扁桃體單個核細(xì)胞BATF表達(dá)水平與AID、Ia-Ca、IgA1呈正相關(guān)。RARα表達(dá)水平與AID、Ia-Ca呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　(1) RARα在IgAN患者腭扁桃體中表達(dá)上調(diào)與IgA1類別轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)增高密切相關(guān),說明RA/RARα可能通過促進(jìn)IgA1類別轉(zhuǎn)換增加IgA1的合成。(2) BATF在IgAN患者腭扁桃體

16、表達(dá)上調(diào),且與RARα及IgA1類別轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)增高一致,提示BATF可能參與調(diào)節(jié)RA/ RARα促進(jìn)扁桃體單個核細(xì)胞IgA1類別轉(zhuǎn)換的過程。
　　第三章：脂多糖、甲型溶血性鏈球菌對腭扁桃體單個核細(xì)胞RA、RARα、 BATF、AID、Ia-Ca、IgA1的影響
　　目的:
　　采用脂多糖(lipopolysaccharide LPS)、甲型溶血性鏈球菌（α-Hemolytic streptococcus HS）刺

17、激腭扁桃體單個核細(xì)胞,探討RA/RARα通路及BATF在LPS、HS促進(jìn)扁桃體單個核細(xì)胞AID、Iα-Cα表達(dá)及IgA1分泌中的作用。
　　方法:
　　腭扁桃體單個核細(xì)胞培養(yǎng)體系中,分別加入LPS(終濃度為10ug/ml)、滅活的HS（濃度為1×108cfu/ml）刺激72小時,RT-PCR技術(shù)分別測定RARα、BATF、AID、Ia-Ca mRNA量;Westernblot技術(shù)分別測定RARα、BATF、AID蛋白表達(dá),E

18、LISA技術(shù)測定培養(yǎng)液上清中IgA1及RA水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.IgAN腭扁桃體單個核細(xì)胞接受LPS、HS刺激后,RARα、BATF、AID、Ia-Ca mRNA和RARα、BATF、AID蛋白表達(dá)均上調(diào),IgA1、RA分泌增加,HS較LPS上調(diào)作用更為明顯。
　　2.CT組在LPS、HS刺激下,RARα、BATF、AID、Ia-CamRNA和RARα、BATF、AID蛋白表達(dá)均上調(diào),IgA1分泌增加。但增

19、高程度低于IgAN組。
　　結(jié)論:
　　LPS、HS通過激活I(lǐng)gA腎病腭扁桃體RA/RARα信號通路,上調(diào)BATF表達(dá),促進(jìn)IgA1的類別轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致IgA1分泌增多。
　　第四章：RARα-siRNA或BATF-siRNA對甲型溶血性鏈球菌及脂多糖誘導(dǎo)的腭扁桃體單個核細(xì)胞IgA類別轉(zhuǎn)化的影響
　　目的:
　　擬分別采用RARα-siRNA及BATF-siRNA沉默RARα及BATF基因表達(dá),觀察其對LPS、

20、HS刺激下腭扁桃體單個核細(xì)胞IgA1類別轉(zhuǎn)化的影響。觀察BATF-siRNA對RA刺激下腭扁桃體單個核細(xì)胞IgA1類別轉(zhuǎn)化的影響,初步探討RA/RARα與BATF在促進(jìn)扁桃體單個核細(xì)胞IgA1類別轉(zhuǎn)化中的關(guān)系。
　　方法:
　　分離腭扁桃體單個核細(xì)胞,轉(zhuǎn)染RARα-siRNA及BATF-siRNA,用RT-PCR、Western blot方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后, AID、Ia-Ca mRNA和AID蛋白表達(dá);ELISA測定培養(yǎng)

21、液上清中IgA1水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染RARα-siRNA后,無論有無LPS、HS刺激,IgAN患者扁桃體單個核細(xì)胞AID、Ia-Ca mRNA水平均明顯下降,AID蛋白水平及IgA1較未轉(zhuǎn)染組降低。
　　2.轉(zhuǎn)染BATF-siRNA后,無論有無LPS、HS刺激,IgAN患者扁桃體單個核細(xì)胞AID、Ia-Ca mRNA水平均明顯下降;AID蛋白水平降低;轉(zhuǎn)染后IgA1水平明顯降低。
　　3.予以R

22、A刺激并轉(zhuǎn)染BATF-siRNA,IgAN患者扁桃體單個核細(xì)胞AID、Ia-Ca mRNA水平較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組明顯下降,IgA1水平明顯降低。
　　結(jié)論:
　　RARα-siRNA或BATF-siRNA轉(zhuǎn)染能降低IgA腎病患者腭扁桃體單個核細(xì)胞AID,Iα-Cα表達(dá)和IgA1分泌。在LPS及HS刺激下,RARα-siRNA和BATF-siRNA轉(zhuǎn)染同樣能減低AID,Iα-Cα表達(dá)。且BATF-siRNA抑制作用更明顯。BATF