MSCs誘導(dǎo)分化及向缺氧缺血腦損傷大鼠側(cè)腦室移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文為了研究骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)在體內(nèi)外條件下增殖和分化的特點(diǎn)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較了MSCs在體外的不同分離培養(yǎng)方法和誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的不同條件，觀察了體外培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs通過側(cè)腦室移植到新生大鼠HIE模型后，移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化情況。研究工作分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)： 實(shí)驗(yàn)一： 研究目的：研究體外擴(kuò)增培養(yǎng)MSCs的不同方法及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的條件，并對分化細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 研究方法：用

2、無菌注射器吸取DMEM沖洗幼年SD大鼠四肢骨的骨髓腔，將收集的沖洗液通過密度梯度離心分離出單核細(xì)胞，然后分別接種到A組：DMEM/10％FBS(含bFGF和EGF)培養(yǎng)基和B組：DMEM/10％FBS(不含bFGF和EGF)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3d更換一次培養(yǎng)液以去除非黏附細(xì)胞。 研究結(jié)果：通過倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈貼壁生長，梭形或扁平狀，伸出突起。A組培養(yǎng)至7-9d左右有分化的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)，免疫組化表達(dá)NS

3、E(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)可存活7d以上。B組則培養(yǎng)到15d左右細(xì)胞融合，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，將第2代的MSCs先用DMEM/10％FBS/1mmol/Lβ-巰基乙醇(BME)預(yù)誘導(dǎo)24h，再用DMEM/5mmol/LBME誘導(dǎo)，1h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞體收縮，伸出細(xì)小突起，6h時(shí)細(xì)胞突起延長，互相連接成網(wǎng)狀，呈神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)NSE(71±8.8)％，分化細(xì)胞24h后逐漸死亡；

4、 研究結(jié)論：A組(加bFGF和EGF)培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖效能明顯高于B組(未加bFGF和EGF)，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MSCs在A組條件下培養(yǎng)可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表達(dá)NSE(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化細(xì)胞存活達(dá)7d以上。 實(shí)驗(yàn)二： 研究目的：將用A組方法培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs通過側(cè)腦室移植到新生大鼠HIE模型腦內(nèi)，觀察MSCs在腦內(nèi)的存活、遷移、分化情況。 研究方法：移植前48h用

5、BrdU標(biāo)記MSCs。建立出生后7d(P7)新生SD大鼠HIBD模型，即將新生大鼠乙醚麻醉后，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈造成一側(cè)腦缺血，1h后在密閉有機(jī)玻璃艙內(nèi)呼吸8％O2和92％N2的條件下缺氧2h造成HIE，并分為4組處理：①HIBD模型對照組(HIBD后未予任何處理)；②MSCs移植組(HIBD后將BrdU標(biāo)記的MSCs4×103/2μl注射到左側(cè)側(cè)腦室內(nèi))；③生理鹽水對照組(HIBD后將生理鹽水2μl注射到左側(cè)側(cè)腦室內(nèi))；④正常對照組(未予

6、任何處理)。分別在移植后7d、14d、21d等不同時(shí)間點(diǎn)用4％多聚甲醛心臟灌注后取鼠腦制作組織切片，通過光鏡、透射電鏡(TEM)、免疫熒光和免疫組化等方法觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化情況。 研究結(jié)果：正常對照組的腦組織結(jié)構(gòu)正常，MSCs移植組移植后7dHE染色可見腦組織結(jié)構(gòu)層次欠清晰，細(xì)胞輕度水腫，有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，與HIE對照組、生理鹽水對照組相比，無明顯差異。14d時(shí)各組的腦組織結(jié)構(gòu)基本正常；通過透射電鏡(TEM)

7、觀察HIBD模型對照組和MSCs移植組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)前組的細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、空泡化，少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，后組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，有較多的小膠質(zhì)細(xì)胞，可見含有豐富細(xì)胞器的原始分化細(xì)胞，類似神經(jīng)細(xì)胞。免疫熒光染色可見BrdU(+)細(xì)胞左側(cè)海馬區(qū)。移植后7dBrdU(+)細(xì)胞(184±66)主要分布在左側(cè)側(cè)腦室附近的室管膜下區(qū)(SVZ)；14d時(shí)在右側(cè)腦白質(zhì)可以見到，但多數(shù)BrdU(+)細(xì)胞(82±39)分布在左側(cè)海馬區(qū)、SVZ，呈

8、灶狀分布，少數(shù)散在分布在皮層。21d時(shí)BrdU(+)細(xì)胞(37±5)較前減少。BrdU(+)細(xì)胞中70％表達(dá)GFAP(+)，5％表達(dá)NSE(+)。 研究結(jié)論：MSCs側(cè)腦室移植后可在新生大鼠HIBD腦內(nèi)存活、遷移、分化。 小結(jié)：在體外用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基加神經(jīng)生長因子bFGF和EGF較為滿意地?cái)U(kuò)增培養(yǎng)了大鼠MSCs，并誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，NSE和GFAP陽性表達(dá)分別達(dá)(52±9.2)％和(15±7)％。將MSCs