MSCs誘導分化及向缺氧缺血腦損傷大鼠側腦室移植的實驗研究.pdf

1、本文為了研究骨髓基質細胞(MSCs)在體內(nèi)外條件下增殖和分化的特點，通過動物實驗比較了MSCs在體外的不同分離培養(yǎng)方法和誘導分化為神經(jīng)細胞的不同條件，觀察了體外培養(yǎng)擴增的MSCs通過側腦室移植到新生大鼠HIE模型后，移植細胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化情況。研究工作分為兩個實驗： 實驗一： 研究目的：研究體外擴增培養(yǎng)MSCs的不同方法及誘導分化為神經(jīng)細胞的條件，并對分化細胞進行形態(tài)學和免疫細胞化學鑒定。 研究方法：用

2、無菌注射器吸取DMEM沖洗幼年SD大鼠四肢骨的骨髓腔，將收集的沖洗液通過密度梯度離心分離出單核細胞，然后分別接種到A組：DMEM/10％FBS(含bFGF和EGF)培養(yǎng)基和B組：DMEM/10％FBS(不含bFGF和EGF)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，每2-3d更換一次培養(yǎng)液以去除非黏附細胞。 研究結果：通過倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的細胞呈貼壁生長，梭形或扁平狀，伸出突起。A組培養(yǎng)至7-9d左右有分化的神經(jīng)細胞出現(xiàn)，免疫組化表達NS

3、E(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化細胞繼續(xù)培養(yǎng)可存活7d以上。B組則培養(yǎng)到15d左右細胞融合，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，將第2代的MSCs先用DMEM/10％FBS/1mmol/Lβ-巰基乙醇(BME)預誘導24h，再用DMEM/5mmol/LBME誘導，1h后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞體收縮，伸出細小突起，6h時細胞突起延長，互相連接成網(wǎng)狀，呈神經(jīng)元樣細胞形態(tài)，表達NSE(71±8.8)％，分化細胞24h后逐漸死亡；

4、 研究結論：A組(加bFGF和EGF)培養(yǎng)基的細胞增殖效能明顯高于B組(未加bFGF和EGF)，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。MSCs在A組條件下培養(yǎng)可分化為神經(jīng)元樣細胞，表達NSE(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化細胞存活達7d以上。 實驗二： 研究目的：將用A組方法培養(yǎng)擴增的MSCs通過側腦室移植到新生大鼠HIE模型腦內(nèi)，觀察MSCs在腦內(nèi)的存活、遷移、分化情況。 研究方法：移植前48h用

5、BrdU標記MSCs。建立出生后7d(P7)新生SD大鼠HIBD模型，即將新生大鼠乙醚麻醉后，結扎左頸總動脈造成一側腦缺血，1h后在密閉有機玻璃艙內(nèi)呼吸8％O2和92％N2的條件下缺氧2h造成HIE，并分為4組處理：①HIBD模型對照組(HIBD后未予任何處理)；②MSCs移植組(HIBD后將BrdU標記的MSCs4×103/2μl注射到左側側腦室內(nèi))；③生理鹽水對照組(HIBD后將生理鹽水2μl注射到左側側腦室內(nèi))；④正常對照組(未予

6、任何處理)。分別在移植后7d、14d、21d等不同時間點用4％多聚甲醛心臟灌注后取鼠腦制作組織切片，通過光鏡、透射電鏡(TEM)、免疫熒光和免疫組化等方法觀察移植細胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化情況。 研究結果：正常對照組的腦組織結構正常，MSCs移植組移植后7dHE染色可見腦組織結構層次欠清晰，細胞輕度水腫，有少量膠質細胞增生，與HIE對照組、生理鹽水對照組相比，無明顯差異。14d時各組的腦組織結構基本正常；通過透射電鏡(TEM)

7、觀察HIBD模型對照組和MSCs移植組的海馬神經(jīng)元細胞超微結構，發(fā)現(xiàn)前組的細胞內(nèi)線粒體腫脹、空泡化，少量膠質細胞增生，后組的細胞結構正常，有較多的小膠質細胞，可見含有豐富細胞器的原始分化細胞，類似神經(jīng)細胞。免疫熒光染色可見BrdU(+)細胞左側海馬區(qū)。移植后7dBrdU(+)細胞(184±66)主要分布在左側側腦室附近的室管膜下區(qū)(SVZ)；14d時在右側腦白質可以見到，但多數(shù)BrdU(+)細胞(82±39)分布在左側海馬區(qū)、SVZ，呈

8、灶狀分布，少數(shù)散在分布在皮層。21d時BrdU(+)細胞(37±5)較前減少。BrdU(+)細胞中70％表達GFAP(+)，5％表達NSE(+)。 研究結論：MSCs側腦室移植后可在新生大鼠HIBD腦內(nèi)存活、遷移、分化。 小結：在體外用常規(guī)細胞培養(yǎng)基加神經(jīng)生長因子bFGF和EGF較為滿意地擴增培養(yǎng)了大鼠MSCs，并誘導MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞，NSE和GFAP陽性表達分別達(52±9.2)％和(15±7)％。將MSCs