人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的影響及其機理探討.pdf

1、第一部分體外培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)生物學(xué)特征研究
　　 目的:探討體外培養(yǎng)的人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(human amnion mesenchymal cells,hAMCs)的神經(jīng)生物學(xué)特征、神經(jīng)營養(yǎng)作用,以及hAMCs與新生鼠腦組織液共培養(yǎng)后向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測hAMCs的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白STRO-1、vimentin,神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白nestin、PSA-N

2、CAM,神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,以及與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白Math-1、Mash-1的表達。應(yīng)用PCNA形態(tài)學(xué)檢測、BrdU摻入法和MTS法確認(rèn)hAMCs的增殖活性。
　　 2.ELISA檢測培養(yǎng)7d后的hAMCs內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的神經(jīng)營養(yǎng)因子NT3、β-NGF和BDNF的合成分泌狀態(tài)。
　　 3.將10日齡新生SD大鼠腦組織勻漿上清液與hAMCs共培養(yǎng)10d后,應(yīng)用免疫蛋白印記法比較共培養(yǎng)前后vi

3、mentin、NSE、NF表達的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)的hAMCs不僅表達問充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白STRO-1和vimentin,還可見神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白nestin和PSA-NCAM的表達；
　　 2.體外培養(yǎng)的hAMCs表達神經(jīng)元標(biāo)記蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,同時還表達神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白Math-1、Mash-1；
　　 3.hAMCs表現(xiàn)為PCNA和BrdU免疫熒光染色陽性；

4、r>　　 4.MTS分析法顯示hAMCs在接種后第6～8d增殖速度最快,第8～24d活細(xì)胞數(shù)基本保持穩(wěn)定。
　　 5.部分hAMCs表現(xiàn)為TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU雙陽性。
　　 6.hAMCs內(nèi)及細(xì)胞上清中均檢測到不同水平的NT3、β-NGF和BDNF神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成分泌。7.與新生大鼠腦組織上清液共培養(yǎng)后,hAMCs的vimentin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記蛋白NSE、NF的表達數(shù)量顯著增加。

5、r>　　 結(jié)論:體外培養(yǎng)的hAMCs表達神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的特異性標(biāo)記蛋白,并且具有增殖活性和神經(jīng)細(xì)胞分化潛能。體外培養(yǎng)hAMCs能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞,這可能與神經(jīng)元分化相關(guān)基因Math-1、Mash-1的表達有關(guān)。此外,hAMCs可以合成和分泌多種具有神經(jīng)保護和修復(fù)作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子。新生鼠腦中存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子,能夠促使hAMCs向神經(jīng)元方向分化,提示腦內(nèi)具有有利于hAMCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的微環(huán)境。
　　 第二部分體外培養(yǎng)人

6、羊膜間充質(zhì)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究
　　 目的:探討hAMCs在體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的潛能,以期作為細(xì)胞移植治療缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)的種子細(xì)胞。
　　 方法:
　　 1.從健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后廢棄的人羊膜組織分離培養(yǎng)hAMCs,利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)完善體外擴增培養(yǎng)方法,并對其相關(guān)生物學(xué)特性進行鑒定。
　　 2.使用添加血管內(nèi)皮

7、細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMCs,觀察細(xì)胞形態(tài)特征,用免疫熒光染色和Western-Blot的方法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白CD31、vWF和VEGFR-2的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)的hAMCs形態(tài)呈長梭形或不規(guī)則形,呈均勻分布生長,傳代后細(xì)胞體積略變大,約5～7d傳代1次。
　　 2.體外培養(yǎng)的hAMCs表達間充質(zhì)干細(xì)胞(me

8、senchymal stem cells,MSCs)特異性標(biāo)記物STRO-1和vimentin。經(jīng)成血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)12d后,hAMCs中有CD31、vWF和VEGFR-2表達陽性的細(xì)胞。
　　 結(jié)論:hAMCs易于體外分離培養(yǎng)及擴增,體外定向誘導(dǎo)的hAMCs具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能,可能成為治療HIBI的供體細(xì)胞。
　　 第三部分人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的影響
　　 目的:觀

9、察hAMCs移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischaemic braininjury,HIBI)的影響。
　　 方法:從健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后廢棄的人羊膜組織分離培養(yǎng)hAMCs。采用新生7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠結(jié)扎左頸總動脈后低氧暴露4h制作HIBI模型。建模72h后,移植組(n=33)經(jīng)損傷側(cè)腦內(nèi)直接注射hAMCs2×104細(xì)胞/4μ1基礎(chǔ)培養(yǎng)基,移植對照組(n=23)則注入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)

10、基。觀察HIBI后大鼠體重增長情況,行為能力以及腦組織病理形態(tài)學(xué)改變；觀察hAMCs移植對新生大鼠存活率、體重增長的影響；移植后7d應(yīng)用HNA和HMA免疫組織化學(xué)染色檢測hAMCS在腦內(nèi)的存活情況；移植后11d用ELISA法檢測移植后對腦內(nèi)NT3、β-NGF和BDNF水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.HIBI模型組體重增長明顯落后于空白對照組和假手術(shù)組；HIBI制模后大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能受損表現(xiàn)；HE染色可見左

11、側(cè)大腦半球神經(jīng)元損傷及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　 2.移植組和移植對照組的死亡率無差異；d7后移植組的體重增長率較移植對照組逐漸增高。
　　 3.在移植大鼠的皮層下部分區(qū)域均發(fā)現(xiàn)了人源性細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白HNA和HMA陽性細(xì)胞的表達。
　　 4.移植后大鼠腦組織中NT3和BDNF較移植對照組增加,有統(tǒng)計學(xué)差異；而β-NGF含量無明顯變化。
　　 結(jié)論:本研究中新生大鼠HIBI模型是可靠的。hAMCs腦內(nèi)移植