腸球菌中β-D-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學性質研究.pdf

1、銀杏提取物(EGb761)含有24％銀杏黃酮內酯(Ginkgo-flavone glycosides)及6％萜類化合物(Terpenoids),它可望成為治療阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease,AD)的有效藥,但是其臨床前期試驗,包括代謝等還沒有能夠按照藥物研發(fā)的現(xiàn)代標準來進行。銀杏提取物的代謝主要是通過腸道微生物菌群分泌的水解酶來進行的,由此,本文選定腸球菌為模式菌株,通過系列研究不但能夠初步闡明機體代謝吸收銀杏提取物

2、中主要有效成分的酶學及分子生物學的機制,而且為按照現(xiàn)代藥物標準研發(fā)銀杏系列產品做好方法上的準備并提供理論依據(jù),因此具有理論研究和實際應用雙重重要意義。目前,國內外尚未見此方面成功的研究報道。
　　 首先通過響應面法優(yōu)化設計得到了腸球菌最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1.87896％、酵母膏0.77474％、牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、KNO36.25 mmol/L、NaCl0.5％,最適培養(yǎng)條件為:裝液量60 mL、初始pH7.0、接種

3、量3％、溫度36℃,接種后置于170 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)20 h后,于OD560處測定吸光度值為0.748,比優(yōu)化前的0.682提高了9.7％。
　　 其次確定了腸球菌中β-D-葡萄糖苷酶的酶活測定方法:在10mL具塞比色管中加入1.5 mL pH5.0的0.02 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,再用適當刻度的移液槍吸取0.1 mL粗酶提取液加入其中,于45℃恒溫水浴中預熱一定時間,再加入已預熱5～10 min的0.4

4、 mL1 mmol/L底物pNPG溶液,用秒表精確計時,14 min后取出立即加入42 mL1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,在比色管架上冷卻至室溫,于400nm處測光吸收值。
　　 再次通過單因素和正交實驗對腸球菌產β-D-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,得到基礎產酶培養(yǎng)基的最佳配比為:玉米粉3％,酵母浸粉1.2％,蛋白胨1％,葡萄糖2％,K2HPO40.1％,MgSO47.5 mmol/L；相應的最佳腸球菌產酶發(fā)酵條

5、件為:初始pH7.0,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時間168 h,搖床轉速180 r/min,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),接種量為3％,此時腸球菌產β-D-葡萄糖苷酶的酶活最高,達到19.1242 U/(mL·min)。
　　 腸球菌產β-D-葡萄糖苷酶發(fā)酵液經(jīng)過40％～80％硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素52陰離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過濾層析等步驟分離純化得到了β-D-葡萄糖苷酶純品,該酶的比活力由

6、3.37 U/mg提高到33 U/mg,純化倍數(shù)為9.79倍,且酶的回收率為5.33％。提純酶蛋白經(jīng)NATURE-PAGE和SDS-PAGE電泳,確定來源于腸球菌的β-D-葡萄糖苷酶相對分子量約為121KD,由兩個亞基組成(65KD和54KD)。提純后的β-D-葡萄糖苷酶經(jīng)酶學性質研究發(fā)現(xiàn)酶耐酸性較強,具有較強的熱穩(wěn)定性。5 mmol/L的Mg2+、Ba2+、Ca2+對β-葡萄糖苷酶有激活作用；而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+對酶