蠟梅花β-葡萄糖苷酶的活性分析、分離純化與性質(zhì)的初步研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是香花中醇系香氣形成的關(guān)鍵酶類。本文在優(yōu)化β-葡萄糖苷酶提取以及活性分析條件的基礎(chǔ)上，比較蠟梅不同品種和鮮花開放不同時(shí)期β-葡萄糖苷酶活性的變化，并首次對(duì)蠟梅花β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化和有關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究，為今后深入研究蠟梅花香形成機(jī)理提供理論依據(jù)。本項(xiàng)研究主要研究結(jié)果如下：1.蠟梅花β-葡萄糖苷酶提取和活性分析條件的優(yōu)化。 以pNPG為底物，對(duì)蠟梅花中β-葡萄糖苷酶提取和活性分析條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，PVP

2、加入量對(duì)酶活性影響較大。隨著PVP加入量的增大，酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)PVP加入量與花等量時(shí)，酶活性達(dá)到最大值。緩沖液類型和pH值對(duì)酶活性也有較大影響。隨著pH值的增大，酶活性均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)pH為5.0時(shí)酶活性達(dá)到最大值。在相同pH條件下，檸檬酸-檸檬酸三鈉提取的酶活性最大。酶的吸收波長分析結(jié)果表明，在波長為410nm下測定β-葡萄糖苷酶，能獲得最大的光吸收值。酶促反應(yīng)以37℃為宜，在此條件下反應(yīng)120分鐘內(nèi)酶活性分析結(jié)果具

3、有穩(wěn)定性。據(jù)此，β-葡萄糖苷酶提取條件為：加入與花等量的PVP，以pH為5.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉作為提取緩沖液;而β-葡萄糖苷酶活性分析的條件為：酶促反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為120分鐘內(nèi)，測定波長為410nm。 2.蠟梅不同品種和鮮花開放不同時(shí)期β-葡萄糖苷酶活性變化 素心蠟梅Ⅰ、素心蠟梅Ⅱ、罄口蠟梅和狗蠅蠟梅花中β-葡萄糖苷酶活性變化的研究表明，從黃蕾到全開過程，素心蠟梅Ⅱ花中β-葡萄糖苷酶活性均高于其它蠟梅品種

4、，素心蠟梅Ⅰ和罄口蠟梅居中，而狗蠅蠟梅最低。在鮮花開放的不同時(shí)期，不同蠟梅品種鮮花β-葡萄糖苷酶活性的變化趨勢大體上一致，均表現(xiàn)為黃蕾＞初開＞全開＞青蕾＞萎蔫，從黃蕾到全開過程β-葡萄糖苷酶活性略有下降，但保持在較高水平，而從全開到萎蔫的過程酶活性下降迅速。提示蠟梅花香氣的變化與內(nèi)源β-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)。 3.β-葡萄糖苷酶的分離純化 采用硫酸銨分級(jí)沉淀法和CM-52Cellulose離子交換層析法對(duì)素心蠟梅Ⅱ花中β

5、-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，得到Glucosidase-Ⅰ、Glucosidase-Ⅱ和Glucosidase-Ⅲ3個(gè)酶級(jí)分。利用SephadexG-100葡聚糖凝膠柱層析對(duì)主要級(jí)分Glucosidase-Ⅲ進(jìn)一步純化，能得到純度較高的β-葡萄糖苷酶主要級(jí)分Glucosidase-Ⅲ，該酶的純化倍數(shù)提高了12.6倍，得率為2.4％，比酶活為0.244U/mg。 4.β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 Glucosidase-Ⅲ酶

6、學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶最適pH為4.0，在pH4.0-6.0之間比較穩(wěn)定，最適溫度為50℃，熱穩(wěn)定范圍在30℃一40℃之間;Glucosidase-Ⅲ酶可能由分子量為64.5KD和42.0KD的兩種亞基組成；對(duì)底物pNPG的米氏常數(shù)Km為0.23mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmsx為12.24U/L；Hg2+、Ag+、SDS對(duì)Glucosidase-m有強(qiáng)的抑制作用，Cu2+、Fe2+對(duì)酶有一定的抑制作用；在4℃下保存一個(gè)月，酶活性仍在80