傳染性法氏囊病病毒流行株的分離與檢測(cè)方法的建立.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雛雞傳染病，IBDV感染雛雞后引起法氏囊萎縮，最終導(dǎo)致死亡。給世界商業(yè)化養(yǎng)雞行業(yè)造成巨大損失。因此對(duì)IBD的流行病學(xué)調(diào)查及研制快速、準(zhǔn)確的IBDV檢測(cè)方法至關(guān)重要。本研究對(duì)華東區(qū)域傳染性法氏囊病病毒流行株進(jìn)行分離及生物學(xué)性狀分析，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)建立了IBDV雙抗體夾心ELISA和膠體金試紙條檢測(cè)方法，為今后IBD的綜合防治提供幫助。
　　試驗(yàn)一:華東區(qū)域傳染性法氏

2、囊病病毒流行株的分離及其生物學(xué)特性分析
　　為了解華東區(qū)域近年來(lái)IBDV的遺傳變異現(xiàn)狀，從該地區(qū)近三年來(lái)IBD疫苗免疫失敗雞群中分離到7株IBDV，命名為J3、A4、S8、S9、A11、S14和J17。7株IBDV均能直接適應(yīng)于雞胚培養(yǎng)，但對(duì)CEF、DF-1以及DF-EGFP-miR-9三種細(xì)胞的適應(yīng)性和細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒滴度有顯著差異，較易適應(yīng)于DF-EGFP-miR-9細(xì)胞，A11毒株在DF-EGFP-miR-9細(xì)胞中的滴度高達(dá)

3、1011TCID50/0.1ml。用第3代雞胚毒分別感染6周齡SPF雛雞，均表現(xiàn)出臨床癥狀和死亡，發(fā)病率為100％,死亡率在50％～70％，而用第20代細(xì)胞毒感染的SPF雛雞，均未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡。將7株IBDV分離毒vp2基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源性分析，核苷酸和編碼氨基酸序列的同源性分別為97.4％～99.6％和98.7％～99.8％。遺傳進(jìn)化分析，7株IBDV分離毒均屬于血清Ⅰ型，分布在三個(gè)相對(duì)獨(dú)立的超強(qiáng)毒力IBDV(vvIBDV)分

4、枝中，特征性氨基酸位點(diǎn)表現(xiàn)出IBDV強(qiáng)毒株特性。在vp2第一親水區(qū)，J17毒株有212N，S14毒株有222L，不同于其它強(qiáng)毒株或弱毒株。本研究結(jié)果表明，近年來(lái)，在華東區(qū)域IBD免疫失敗的雞群中流行著超強(qiáng)毒力vvIBDV，毒株的生物學(xué)特性有明顯差異，毒株的來(lái)源比較復(fù)雜，IBD的防控面臨著新挑戰(zhàn)。
　　試驗(yàn)二:分泌傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
　　分別用純化的傳染性法氏囊病病毒和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的重組VP2蛋白免

5、疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體技術(shù)，制備脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)篩選和克隆化，獲得2株能穩(wěn)定分泌傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4G8和2C9，抗體亞類(lèi)分別為IgG2a和IgM。間接ELISA檢測(cè)表明，2株單克隆抗體均只與IBDV VP2蛋白反應(yīng)，而與其他4種禽類(lèi)病毒及CEF細(xì)胞均無(wú)交叉反應(yīng)，腹水效價(jià)分別為107和108。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)證明，2株單抗均與傳染性法氏囊病病毒細(xì)胞適應(yīng)毒和

6、重組VP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng);western blot分析表明，只有4G8能特異性識(shí)別傳染性法氏囊病病毒和重組VP2蛋白的線性表位;病毒中和實(shí)驗(yàn)分析表明，單抗4G8腹水中和效價(jià)為107，單抗2C9無(wú)中和活性。
　　試驗(yàn)三:傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
　　本實(shí)驗(yàn)以mAb-2C9為捕獲抗體，以HRP-4G8為標(biāo)記抗體，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，建立檢測(cè)傳染性法氏囊病病毒的單克隆抗體夾心ELISA方法。特異性試驗(yàn)

7、證明，單克隆抗體夾心ELISA方法與實(shí)驗(yàn)室保存的四種禽病毒(NDV、AIV H9N2、IBV、EDSV)、CEF細(xì)胞和正常SPF雞組織均無(wú)交叉反應(yīng);敏感性實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用所建立的方法對(duì)傳染性法氏囊病病毒細(xì)胞適應(yīng)毒的最低檢出量為102.8TCID50;重復(fù)性試驗(yàn)表明，夾心ELISA方法同一批次內(nèi)及不同批次間檢測(cè)相同樣品的變異系數(shù)均小于10％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的夾心ELISA方法特異性好、敏感性高、與其他方法符合率高，可用于傳染性法氏囊病

8、的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　試驗(yàn)四:傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備
　　用mAb-4G8作為金標(biāo)記抗體，mAb-2C9作為檢測(cè)抗體，根據(jù)建立的夾心ELISA方法制備傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。經(jīng)過(guò)比較優(yōu)化，確定膠體金溶液最適顆粒直徑大小為20～30nm，最適pH為8.0，最適mAb-4G8工作濃度為18μg/mL，mAb-2C9最佳包被濃度為1.5mg/mL，質(zhì)控抗體