傳染性法氏囊病病毒對(duì)CEF細(xì)胞某些基因表達(dá)的影響和傳染性喉氣管炎病毒的重組.pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文傳染性法氏囊病病毒對(duì)CEF細(xì)胞某些基因表達(dá)的影響和傳染性喉氣管炎病毒的重組姓名：李義平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張曼夫20040501中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博二L 學(xué)位論文或F 5 2 f T 0 攻毒的雞的法氏囊中，不能檢測(cè)出w l B D V 幣lF 5 2 ／7 0 ，只在一些雞中檢測(cè)出D 7 8 。此方法可應(yīng)用于I B D V 的分型，也可以對(duì)同一組織中不同類(lèi)型的I B D V 進(jìn)行定量

2、研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)I B D V的致病性和I B D V 與宿主相互作用研究提供了重要的參考信息。第二部分：實(shí)驗(yàn)克隆了中國(guó)l L l ‘VE 2 株的帶側(cè)翼序列的T K 基因，得到質(zhì)粒p C R T - 兀l K ，并進(jìn)行序列分析。然后用A c c I I I 和V a n 9 1 I 刪除T K 基因內(nèi)部6 7 7b p 的序列。在此刪除位點(diǎn)分別插入C M V - G F P —p o l y A 和S V 4 0 - G F P -

3、p o l y A 表達(dá)盒分別得到質(zhì)粒p F T K - S G 和p F T K - S G 。將新城疫融合基因( F ) 分別插入到質(zhì)粒p F T K - C G 和p F T K - S G 中的G F P 的上游，與G F P 構(gòu)成融合表達(dá)框，得到質(zhì)粒p F T - C F G 和p F T _ S F G 。另外，構(gòu)建T K 缺失的不帶外源基因的重組質(zhì)粒p F T K D 。用質(zhì)粒p F T K - C G p F T K -

4、 S G , p F T - C F G 和p F T - S F G 與I L T V 基因組D N A 共轉(zhuǎn)染L M H 細(xì)胞和雞原代肝細(xì)胞，用熒光顯微鏡檢測(cè)帶熒光的I L l l V 重組子。病毒重綢子在雞原代肝細(xì)胞中傳第二代時(shí)，還可見(jiàn)到熒光，說(shuō)明帶G F P 和F - ( 3 F P 的重組I L T V 在轉(zhuǎn)染時(shí)已經(jīng)產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)C M V 啟動(dòng)予比S V 4 0 啟動(dòng)子有更強(qiáng)的啟動(dòng)效率。重組子的純化與性質(zhì)測(cè)定有待進(jìn)一步鑒定。第三

5、部分：應(yīng)用R T - P C R 結(jié)合探針雜交的方法對(duì)新城疫病毒( N D V ) 進(jìn)行分型。先用感染N D v 的雞胚尿囊液建立實(shí)驗(yàn)方法，再用感染雞的組織進(jìn)行該方法的應(yīng)州效能檢測(cè)。V C 2 2 是毒力株特異探針，N C 2 2 是非毒力株特異探針．用地高辛( D I G ) 標(biāo)記探針3 ’端．在尼龍膜上與N D VR T - P C R 產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。兩個(gè)探針能很好的區(qū)分來(lái)自感染雞胚尿囊液的N D V ，并可區(qū)分感染組織中的N

6、D V強(qiáng)弱毒。對(duì)各毒株的雜交檢測(cè)結(jié)果與腦內(nèi)致病指數(shù)( I C P I ) 判定的強(qiáng)弱毒結(jié)果相一致，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在j 天內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)對(duì)兩個(gè)探針的特異性和N C 2 2 的靈敏度進(jìn)行測(cè)試．N C 2 2 能檢測(cè)到將1 0 7 。5E I D s o ，m l 的L a S o t a 毒株稀釋到1 0 4 稀釋度或8 0 0 龜?shù)牟《綬 N A 。本系統(tǒng)在臨床樣品的檢測(cè)上有一定的麻用價(jià)值。關(guān)鍵j 司：傳染性法氏囊病病毒，定量實(shí)時(shí)R T —