抗雞傳染性法氏囊病病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害3-6周齡雛雞及青年雞，使雞群發(fā)病、死亡，同時(shí)病毒侵害雞法氏囊B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，誘發(fā)雞群疫苗免疫失敗，并對(duì)其他疾病的易感性增加，出現(xiàn)繼發(fā)感染或混合感染。因此，傳染性法氏囊病被認(rèn)為是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)成功獲得了GST-VP2和GS

2、T-VP3的可溶性重組蛋白，并以此表達(dá)產(chǎn)物建立了檢測(cè)IBDV抗體的ELISA方法;同時(shí)，應(yīng)用IBDV-JS株感染SPF雞，制備了IBDV抗原和陽性血清，并對(duì)抗原和抗體進(jìn)行了一系列的鑒定和標(biāo)定，獲得了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清，為IBDV的診斷提供了有效的方法和材料。
　　1.檢測(cè)IBDV抗體ELISA方法的建立
　　本研究根據(jù)IBDV-JS株的序列，分別設(shè)計(jì)了VP2和VP3基因的特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法對(duì)VP

3、2和VP3基因的全長進(jìn)行了擴(kuò)增，然后將目的片段經(jīng)雙酶切克隆至表達(dá)載體pGEX-6p-1，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽性細(xì)菌克隆送公司測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG終濃度分別為0.75mM和0.25mM時(shí)，細(xì)菌裂解上清中GST-VP2(約80KDa)和GST-VP3(約52

4、KDa)的表達(dá)量最高。蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western-Blot)結(jié)果顯示GST-VP2和GST-VP3重組蛋白均與IBDV陽性血清反應(yīng)，表明重組蛋白具有良好的抗原性。
　　將純化后的重組蛋白GST-VP2和GST-VP3分別作為包被抗原，建立檢測(cè)IBDV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，確定VP2、VP3抗原最佳包被量分別為5μg/ml、0.625μg/ml，待檢血清最佳稀釋度為1∶400，最佳孵育時(shí)

5、間為30 min，酶標(biāo)二抗最佳孵育時(shí)間為30min，底物最佳顯色時(shí)間為15min。用建立的ELISA方法檢測(cè)50份SPF雞陰性血清，以確定陽性臨界值:對(duì)基于VP2重組融合蛋白建立的ELISA方法，當(dāng)OD650＞0.12時(shí)，判為陽性;對(duì)基于VP3重組融合蛋白建立的ELISA方法，當(dāng)OD650＞0.136時(shí)，判為陽性。交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)證明本研究建立的抗體ELISA檢測(cè)方法僅與IBDV陽性血清反應(yīng)，與IBV、ILTV、MDV、ALV、EDSV、

6、AIV-H9、NDV、REV、GPV等陽性血清均不反應(yīng)，特異性良好。該方法的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10％，說明該方法可行、重復(fù)性好。用已建立的2種IBDV抗體檢測(cè)ELISA方法檢測(cè)采集自江蘇地區(qū)的77份雞血清樣品，并與IDEXX公司以及BioChek公司的IBDV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)進(jìn)行比較。結(jié)果VP2蛋白建立的ELISA與兩種商品化試劑盒的檢測(cè)符合率分別達(dá)到94.8％和96.1％;VP3蛋白建立的ELISA與兩種商品化試劑盒的檢測(cè)符

7、合率僅為58.44％和59.7％。比較結(jié)果表明，用VP2蛋白建立的ELISA方法更適用于臨床樣本的檢測(cè)。
　　2.雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制
　　本研究使用IBDV-JS株經(jīng)泄殖腔、點(diǎn)眼感染28日齡SPF雞，無菌取病死雞法氏囊組織進(jìn)行研磨，通過離心和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行病毒純化，對(duì)純化的病毒抗原含量進(jìn)行了標(biāo)定。純化后的病毒進(jìn)行PCR鑒定、純粹性鑒定、瓊擴(kuò)效價(jià)測(cè)定以及Western-blot分析，結(jié)果顯示純化后

8、的IBDV不含IBV、ALV、REV、GPV、MDV、ILTV、AIV、NDV、EDSV等外源性病毒;瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16; Western-blot試驗(yàn)結(jié)果顯示純化的病毒能與抗VP2蛋白的單抗反應(yīng)。純化的病毒經(jīng)滅活后，分裝凍干，檢查凍干品物理性狀，計(jì)算裝量差異系數(shù)(CV)，并進(jìn)行支原體檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、滅活前后以及凍干前后瓊擴(kuò)效價(jià)、穩(wěn)定性、均一性以及長期保存等一系列特性的標(biāo)定，最終研制出雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原。
　　以低劑量I

9、BDV-JS株免疫接種14日齡SPF雞，經(jīng)過兩次加強(qiáng)免疫后，再以強(qiáng)毒（經(jīng)泄殖腔、點(diǎn)眼感染）攻擊，攻擊后12天，靜脈試血，效價(jià)合格后心臟采血，分離血清，并對(duì)血清的特性進(jìn)行測(cè)定。瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果顯示制備的多抗血清效價(jià)為1∶128; Western-blot試驗(yàn)結(jié)果顯示制備的多抗血清與IBDV-JS株、IBDV-Q株反應(yīng)時(shí)均出現(xiàn)兩條特異性條帶，分子量分別約為30kD和65kD;試驗(yàn)結(jié)果顯示制備的抗IBDV血清IFA效價(jià)為1∶1600、ELISA效