桑樹病程相關(guān)蛋白基因MuPR1c及其啟動(dòng)子的功能研究.pdf

1、桑樹是蠶業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是水土保持、防風(fēng)固沙和改善環(huán)境的重要生態(tài)樹種。桑樹病蟲害是影響蠶業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和實(shí)現(xiàn)桑樹生態(tài)價(jià)值的重要因素。開展桑樹抗病分子機(jī)制研究，培育抗性新品種，有利于桑樹作為經(jīng)濟(jì)和生態(tài)樹種在林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮其重要作用。病程相關(guān)蛋白基因PR1s作為一類防衛(wèi)反應(yīng)基因與植株的系統(tǒng)獲得性抗性密切相關(guān)，但其具體的生物活性和抗病機(jī)制還不清楚。本研究根據(jù)獲得的桑樹轉(zhuǎn)錄組信息，克隆得到桑樹PR1蛋白家族基因MuPR1c，并對其生物學(xué)功能進(jìn)行

2、了研究;同時(shí)擴(kuò)增了MuPR1c基因的啟動(dòng)子，并對其活性進(jìn)行了分析，探討了MuPR1c基因的表達(dá)調(diào)控方式。研究結(jié)果為桑樹抗病分子育種提供了候選基因，同時(shí)也為PR1蛋白家族功能和作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本文的主要研究結(jié)果:
　　(1)桑樹病程相關(guān)蛋白基因MuPR1c的功能研究
　　根據(jù)獲得的桑樹轉(zhuǎn)錄組信息，利用PCR技術(shù)克隆得到了桑樹病程相關(guān)蛋白基因MuPR1c(GenBank登錄號:KC453994)，該基因編碼

3、區(qū)全長為609 bp，編碼202個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為22.97 kDa，等電點(diǎn)為6.30。對該蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，MuPR1c蛋白二級結(jié)構(gòu)中富含α-螺旋，其次為β-折疊和延伸片段，而轉(zhuǎn)角僅占4.46％，具有α-β-α夾心結(jié)構(gòu);該蛋白具有一個(gè)典型的信號肽序列，1個(gè)顯著跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)和一個(gè)核輸出信號序列。將克隆得到的MuPR1c基因片段插入到表達(dá)載體pBI121中，成功構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基

4、因擬南芥接種丁香假單胞菌番茄致病變種（Pst DC3000）和灰霉菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥對Pst DC3000和灰霉菌的侵染具有較強(qiáng)的抗性，表明MuPR1c基因?qū)μ岣咧参飳?xì)菌和真菌病的抗性具有一定作用。
　　(2)桑樹病程相關(guān)蛋白MuPR1c的亞細(xì)胞定位分析
　　將MuPR1c基因插入到含有GFP基因的植物表達(dá)載體PROKⅡ中，構(gòu)建了MuPR1 c-GFP融合基因植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥

5、根尖的顯微觀察，證明了桑樹MuPR1c定位于細(xì)胞壁或分泌到細(xì)胞間隙。
　　(3) MuPR1c基因啟動(dòng)子MuPR1c的克隆及其功能分析
　　利用Tail-PCR技術(shù)成功地從桑樹中分離得到MuPR1c基因的啟動(dòng)子序列pMuPR1c。在線啟動(dòng)子分析工具分析發(fā)現(xiàn)該序列包含有啟動(dòng)子的核心元件以及多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，另外還包含多種環(huán)境因子響應(yīng)元件，表明pMuPR1c可能通過不同的信號通路參與植物對外界環(huán)境的響應(yīng)過程。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的