重組人干擾素α1b對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)感染可引起嬰幼兒發(fā)生嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎、肺炎甚至死亡,也是誘發(fā)兒童哮喘的重要危險(xiǎn)因素[1,2]。然而,目前治療RSV感染尚無(wú)特異性抗病毒藥物[3],探尋一種既安全又有效可用于預(yù)防和(或)治療RSV感染的抗病毒藥物仍舊迫切需要。
　　重組人干擾素α1b(recombinanthumaninterferon-α1b,rhIFN-α1b)是一類由我國(guó)自主研制成功

2、獲得我國(guó)生產(chǎn)批文的基因工程類正規(guī)藥品[4],目前主要應(yīng)用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及某些惡性腫瘤的治療[5,6],具有明顯的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能。然而,關(guān)于rhIFN-α1b治療兒童RSV感染僅限國(guó)內(nèi)報(bào)道,缺乏正規(guī)統(tǒng)一的規(guī)范化治療指南,且國(guó)內(nèi)多位專家共識(shí)[7]認(rèn)為“α-干擾素作為抗病毒治療常用藥物,已有臨床使用經(jīng)驗(yàn),但尚無(wú)兒童霧化吸入推薦劑量,其有效性也需進(jìn)一步證實(shí)”。
　　本科RSV系列實(shí)驗(yàn)前期研究了rhIFN-α1b

3、霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠的作用[8]以及小兒病毒性肺炎患兒肌內(nèi)注射rhIFN-α1b的安全性和耐受性[4]。前者研究發(fā)現(xiàn)霧化吸入rhIFN-α1b12μg對(duì)RSV感染小鼠治療有效[8],后者研究發(fā)現(xiàn)在0.3~2.0μg/kg范圍內(nèi)肌內(nèi)注射rhIFN-α1b對(duì)于小兒病毒性肺炎恢復(fù)期患兒耐受性良好,無(wú)明顯毒副作用[4]。因此,本實(shí)驗(yàn)研究rhIFN-α1b多劑量、大劑量霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠的作用,試圖進(jìn)一步探討rhIFN-α1b對(duì)RSV感

4、染小鼠的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)旨在采用rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入和rhIFN-α1b腹腔注射兩種方式對(duì)RSV感染小鼠進(jìn)行干預(yù),通過(guò)光鏡和透射電鏡觀察肺組織病變,熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺組織RSV病毒載量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群和ELISA方法檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平的方法,探討rhIFN-α1b對(duì)RSV感染小鼠的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用,為rhIFN-α1b治療兒童呼吸道RSV感染的臨床

5、用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1)培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞,增殖RSV,收集病毒液。
　　2)提取病毒液RNA,熒光定量RT-PCR進(jìn)行鑒定。
　　3)鑒定其為RSV后,測(cè)定病毒滴度TCID50。
　　4)將BALB/c小鼠隨機(jī)分為10組,每組10只,分別為空白對(duì)照組(1組)、陰性對(duì)照組(1組)、RSV感染模型組(1組)、rhIFN-α1b(3.125μg、12.5μg、25μg、50μg)霧化吸入組

6、(4組)、利巴韋林霧化吸入組(1組)、rhIFN-α1b腹腔注射組(1組)、利巴韋林腹腔注射組(1組)。
　　5)RSV病毒液滴鼻,成功建立RSV感染小鼠模型后,按照分組連續(xù)給予各組小鼠(霧化吸入或腹腔注射)干預(yù)治療5天(空白對(duì)照組除外)。
　　6)于次日采集小鼠全血,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+與CD3+CD8+水平,計(jì)算兩者比值。
　　7)分離小鼠血清,ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-4、IL-17水平。

7、　　8)剖取小鼠肺組織,制作HE染色切片,光鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變,計(jì)算組織病理學(xué)評(píng)分。
　　9)制作電鏡超薄切片,透射電鏡下觀察小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變。
　　10)熒光定量RT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織RSV病毒載量。
　　11)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1)Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)及RSV增殖過(guò)程順利。
　　2)熒光定量RT-PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:斜率-2.62,Y軸截距39.5,相關(guān)系數(shù)0.990

8、,基線范圍6~15,閾值0.16,即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式Y(jié)=-2.62X+39.5。病毒液核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,鑒定其為RSV,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3)根據(jù)Reed-Muench公式,計(jì)算得出RSV病毒液TCID50=10-4.6。
　　4)RSV感染小鼠表現(xiàn)為不同程度的精神萎靡,運(yùn)動(dòng)遲緩,飲食減少,呼吸急促,毛發(fā)豎立無(wú)光澤,部分表現(xiàn)有咳嗽及打噴嚏癥狀,提示RSV感染小鼠模型建立成功。
　　5)光鏡下可見(jiàn)RSV感染模型組小

9、鼠肺組織支氣管與細(xì)支氣管周大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),管腔內(nèi)大量分泌物滲出,肺泡隔顯著增寬,肺泡腔狹窄或消失,肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞及淡紅色透明水腫液。RSV感染模型組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分(24.600分±1.342分)與陰性對(duì)照組(1.600分±2.191分)和空白對(duì)照組(0.800分±1.789分)比較顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組可見(jiàn),隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠肺組織炎性損傷程度下降,肺組織病

10、理學(xué)評(píng)分呈遞減趨勢(shì),4個(gè)劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與RSV感染模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),rhIFN-α1b3.125μg霧化吸入組除外。利巴韋林霧化吸入組小鼠肺組織炎性損傷程度較rhIFN-α1b25μg霧化吸入組嚴(yán)重,利巴韋林腹腔注射組比rhIFN-α1b腹腔注射組肺組織炎性損傷程度略重。
　　6)透射電鏡下可見(jiàn)RSV感染模型組小鼠肺泡隔顯著增厚,充血、出血、水腫明顯,部分有肺實(shí)變表現(xiàn),肺泡

11、腔縮小或消失,腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞與壞死、脫落的細(xì)胞碎片等;Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞為早期凋亡表現(xiàn),胞核異形改變,核染色質(zhì)邊集凝聚,胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡數(shù)量明顯降低,次級(jí)溶酶體數(shù)量增多,線粒體數(shù)量減少,細(xì)胞表面微絨毛變性壞死,雜亂分布,膠原成分形成,細(xì)胞連接疏松,部分已經(jīng)完全脫落;Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞少有早期凋亡表現(xiàn),胞核變化不大,胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量增多,嗜鋨性板層小體數(shù)量增多,分泌、胞吐現(xiàn)象活躍。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組可見(jiàn),小鼠肺組織炎性損傷程度

12、明顯減輕。利巴韋林霧化吸入組可見(jiàn)程度不一的高電子密度致密物沉積現(xiàn)象,連接成線狀或帶狀均勻分布于肺泡隔基底膜區(qū)域,而rhIFN-α1b霧化吸入組與2個(gè)腹腔注射組均未觀察到此類現(xiàn)象。
　　7)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組小鼠肺組織未檢出RSV,RSV感染模型組小鼠肺組織RSV病毒載量最高(153.706±18.982)copies/mg,與其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),rhIFN-α1b3

13、.125μg霧化吸入組與利巴韋林腹腔注射組除外。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結(jié)果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠肺組織RSV病毒載量呈遞減趨勢(shì),rhIFN-α1b25μg霧化吸入組與rhIFN-α1b50μg霧化吸入組抗病毒作用顯著,與其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組小鼠肺組織RSV病毒載量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　8)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

14、顯示RSV感染模型組小鼠外周血CD3+CD4+水平(78.820％±0.973%)最高,CD3+CD8+水平(18.020%±1.628%)最低,兩者比值(4.404±0.415)顯著升高,與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結(jié)果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠外周血CD3+CD4+水平逐漸下降,CD3+CD8+水平逐漸回升,兩者比值降低,rhIFN-α1b50μg霧化吸

15、入組與其余各藥物干預(yù)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),rhIFN-α1b25μg霧化吸入組除外。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　9)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示RSV感染模型組小鼠血清IFN-γ水平最低(39.386pg/mL±11.942pg/mL),IL-4(131.241pg/mL±15.388pg/mL)與IL-17(132.080pg/mL±17.659pg/

16、mL)水平最高,與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結(jié)果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠血清IFNγ水平逐漸回升,IL-4與IL-17水平逐漸下降,rhIFN-α1b50μg霧化吸入組與其余組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1)rhIFN-α1b霧化

17、吸入對(duì)RSV感染小鼠肺組織病毒載量具有良好的抑制作用。
　　2)rhIFN-α1b霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群失衡具有良好的調(diào)節(jié)作用。
　　3)rhIFN-α1b霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平具有良好的調(diào)節(jié)作用。
　　4)rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　5)rhIFN-α1b50μg霧化吸入對(duì)