呼吸道合胞病毒感染巨噬細(xì)胞活化Toll樣受體3、Toll樣受體7介導(dǎo)的抗病毒作用研究.pdf

1、目的：探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞）后，Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）及Toll樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR7）的水平變化，初步研究TLR3和TLR7活化在RSV感染中介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素（interferon，IFN）抗病毒作用及其可能的調(diào)控機(jī)制，為臨床RSV感染的預(yù)防與治療上

2、提供新的思路。
　　 方法：RSV感染體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，預(yù)先分組給予TLR3或TLR7特異性抗體處理，分別于不同時(shí)間點(diǎn)（4h、8h、12h、16h和24h）收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清，并以未感染病毒的細(xì)胞為對(duì)照組。①用Trizol提取細(xì)胞總RNA，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)TLR3、TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）、

3、干擾素調(diào)節(jié)因子7（Interferon regulatory factor 7，IRF7）、干擾素α（IFN-α），干擾素β（IFN-β），RSV融合蛋白基因（F基因）的mRNA表達(dá)量變化；②用免疫印跡（western blot）法檢測(cè)TLR3及TLR7蛋白的表達(dá)變化；③用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α、IFN-β的表達(dá)變化；④用MTT四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率及病毒抑制率變化；⑤空斑形成實(shí)驗(yàn)（p

4、laque forming unit，PFU）測(cè)定各組不同時(shí)間點(diǎn)的病毒復(fù)制滴度。
　　 結(jié)果：①在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，感染組上調(diào)TLR3、TLR7、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、RSV F基因；在給予TLR3抗體組，雖上調(diào)TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β的表達(dá)，但表達(dá)量都比感染組同時(shí)間點(diǎn)下降，且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR7、IRF7、RSV F基因較RSV感染組升高；在給予TLR7抗體組，雖上調(diào)TLR7、IR

5、F7、IFN-α、IFN-β的表達(dá)，但表達(dá)量都比感染組同時(shí)間點(diǎn)下降，且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR3、IRF3、RSV F基因較RSV感染組升高；②在蛋白水平，感染組上調(diào)TLR3、TLR7蛋白的表達(dá)；在給予TLR3抗體組，未檢測(cè)到特異性蛋白條帶；在給予TLR7抗體組，TLR7蛋白表達(dá)量比感染組同時(shí)間點(diǎn)顯著下降；③RSV感染RAW264.7細(xì)胞后，上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量；給予TLR3抗體組，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和

6、IFN-β的分泌量也隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而含量增加，但I(xiàn)FN-β較RSV感染組顯著降低；給予TLR7抗體組，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而含量增加，但I(xiàn)FN-α較RSV感染組顯著降低；④給予TLR3抗體組及給予TLR7抗體組，細(xì)胞存活率均較RSV感染組下降，給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；⑤RSV感染RAW264.7細(xì)胞后，病毒隨時(shí)間的延長(zhǎng)上調(diào)復(fù)制滴度；給予TLR3抗體組與給

7、予TLR7抗體組的病毒復(fù)制滴度都較感染組高，且給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒復(fù)制滴度更高。
　　 結(jié)論：RSV感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后可上調(diào)TLR3、TLR7表達(dá)，其活化后介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素在一定程度上可抑制病毒的增殖水平，通過分別抑制TLR3及TLR7后，I型干擾素含量及細(xì)胞存活率的降低，RSV F基因及病毒滴度的上調(diào)，都說(shuō)明了RSV感染中IFN引起的抗病毒免疫機(jī)制與TLR3及TLR7的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，并且以