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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)后,Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR3)及Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)的水平變化,初步研究TLR3和TLR7活化在RSV感染中介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素(interferon,IFN)抗病毒作用及其可能的調(diào)控機(jī)制,為臨床RSV感染的預(yù)防與治療上
2、提供新的思路。
方法:RSV感染體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞,預(yù)先分組給予TLR3或TLR7特異性抗體處理,分別于不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、12h、16h和24h)收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清,并以未感染病毒的細(xì)胞為對(duì)照組。①用Trizol提取細(xì)胞總RNA,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)TLR3、TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、
3、干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)、干擾素α(IFN-α),干擾素β(IFN-β),RSV融合蛋白基因(F基因)的mRNA表達(dá)量變化;②用免疫印跡(western blot)法檢測(cè)TLR3及TLR7蛋白的表達(dá)變化;③用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α、IFN-β的表達(dá)變化;④用MTT四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率及病毒抑制率變化;⑤空斑形成實(shí)驗(yàn)(p
4、laque forming unit,PFU)測(cè)定各組不同時(shí)間點(diǎn)的病毒復(fù)制滴度。
結(jié)果:①在mRNA轉(zhuǎn)錄水平,感染組上調(diào)TLR3、TLR7、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、RSV F基因;在給予TLR3抗體組,雖上調(diào)TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β的表達(dá),但表達(dá)量都比感染組同時(shí)間點(diǎn)下降,且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TLR7、IRF7、RSV F基因較RSV感染組升高;在給予TLR7抗體組,雖上調(diào)TLR7、IR
5、F7、IFN-α、IFN-β的表達(dá),但表達(dá)量都比感染組同時(shí)間點(diǎn)下降,且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TLR3、IRF3、RSV F基因較RSV感染組升高;②在蛋白水平,感染組上調(diào)TLR3、TLR7蛋白的表達(dá);在給予TLR3抗體組,未檢測(cè)到特異性蛋白條帶;在給予TLR7抗體組,TLR7蛋白表達(dá)量比感染組同時(shí)間點(diǎn)顯著下降;③RSV感染RAW264.7細(xì)胞后,上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量;給予TLR3抗體組,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和
6、IFN-β的分泌量也隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而含量增加,但I(xiàn)FN-β較RSV感染組顯著降低;給予TLR7抗體組,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而含量增加,但I(xiàn)FN-α較RSV感染組顯著降低;④給予TLR3抗體組及給予TLR7抗體組,細(xì)胞存活率均較RSV感染組下降,給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;⑤RSV感染RAW264.7細(xì)胞后,病毒隨時(shí)間的延長(zhǎng)上調(diào)復(fù)制滴度;給予TLR3抗體組與給
7、予TLR7抗體組的病毒復(fù)制滴度都較感染組高,且給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒復(fù)制滴度更高。
結(jié)論:RSV感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后可上調(diào)TLR3、TLR7表達(dá),其活化后介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,通過分別抑制TLR3及TLR7后,I型干擾素含量及細(xì)胞存活率的降低,RSV F基因及病毒滴度的上調(diào),都說明了RSV感染中IFN引起的抗病毒免疫機(jī)制與TLR3及TLR7的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān),并且以
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